과거에 암을 치료하기 위해 연구되었던 저분자 세포독성 의약품 중에는 매우 강한 효능을 가지나, 표적 특이성의 부재로 인한 독성으로 환자에게 사용할 수 없는 경우가 많았다. 이러한 맥락에서 독일의 과학자 Paul Ehrlich로부터 건강한 세포는 남겨두고 질병세포만을 선택적으로 공격하는 magic bullet 개념이 표적 치료제의 시발점으로서 최초로 제시되었다.¹⁾

Magic bullet 개념은 이후 Imatinib과 같은 저분자 의약품부터 Rituximab, Trastuzumab과 같은 단일클론항체 의약품까지 수많은 표적 치료제 개발에 기여하였다. 항체-약물 중합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC) 역시 표적 특이적으로 저분자 세포독성 의약품을 전달하고자 하는 고민에 대한 해답으로 제시된 방법 중 하나이다.²⁾ 항체-약물 중합체는 일반적으로 단일클론항체 의약품과 저분자 세포독성 의약품을 링커로 중합시킨 형태의 약물을 의미한다. 항체-약물 중합체는 단일클론항체 의약품의 표적 특이성이라는 장점과 저분자 세포독성 의약품의 강한 약효의 장점을 결합시켜 약물의 치료역을 넓히고자 하는 목표로 시도되었다.³⁾

일반적인 항체-약물 중합체는 단일클론항체, 페이로드, 링커라는 3가지 구성 요소의 중합체로 이루어져 있으며 그 약리 기전은 다음과 같다(Fig. 1). 항체는 타겟 항원과 특이적으로 결합 및 내포화하여 항체-약물 중합체 분자를 종양 세포로 안내하는 역할을 한다. 그러므로 항체-약물 중합체를 개발할 때, 질병 특이적으로 발현하거나 정상세포와 비교하여 과발현하는 항원을 선정하는 것이 off-target 독성을 줄이기 위한 중요한 고려 사항이다. 치료제 개발에 사용되는 항체의 대부분은 IgG이며, 그중에서도 열 및 pH 환경에 대한 안정성이 높은 IgG1이 가장 많이 활용된다.⁴⁾

Fig. 1. Mechanism of Action of Antibody-Drug Conjugates

페이로드는 실제 약효를 나타내는 역할을 하는 화합물을 뜻하며 일반적으로 저분자 의약품을 의미한다. 이들의 IC50 값은 보통 나노몰농도 이하에서 수 피코몰농도 단위에 이르며 항암제로 활용되는 저분자 의약품에 비해 수십배 이상 강력한 세포 독성 효능을 보여 대부분 그 자체를 의약품으로 활용하기 어렵다⁵⁾(Fig. 2). 페이로드는 종류에 따라 미세소관 중합 및 탈중합 저해, DNA 알킬화 등의 기전을 가지며 최근에는 STING(Stimulator of Interferon Genes) 작용제와 같이 면역을 활성화시키는 페이로드 기전을 활용하는 등의 시도도 있다.^6,7) 페이로드의 중요성은 Enhertu^TM (Trastuzumab deruxtecan)가 임상에서 입증한 유래 없는 유효성에 힘입어 더욱 주목받게 되었다. Enhertu^TM는 HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor ²⁾를 타겟으로 하는 항체인 Trastuzumab에 Exatecan 유도체인 DXd 페이로드를 중합시킨 형태이다. Enhertu^TM는 기존에 HER2 음성으로 분류되던 HER2 저발현 환자에게서도 좋은 효능을 보이며 유방암 치료의 새로운 지평을 열었다는 평을 받고 있다.⁸⁾ Enhertu의 우수한 약효에는 여러 가지 이유가 있겠으나, 그중 결정적인 요인 중 하나로 페이로드의 방관자 효과(bystander effect)가 꼽힌다.⁹⁾ 이후, 유사한 특성을 보이는 Topoisomerase inhibitor 1을 페이로드로 개발하고자 하는 시도가 많아졌으며, 현재까지도 항체-약물 중합체의 페이로드로서의 적절한 특성 및 효능에 관한 논의가 지속되고 있다.^10-12)

Fig. 2. The IC50 value of the payload as a cytotoxic agent

항체-약물 중합체의 마지막 구성 요소는 링커로 항체와 페이로드를 연결해주는 역할을 한다. 링커는 생체 내에서 전신순환할 때는 페이로드가 항체에서 방출되지 않게 안정적으로 중합 상태를 유지하고 종양세포 내 리소좀 및 미세종양환경에서는 페이로드를 특이적으로 방출할 수 있어야한다.¹³⁾ 링커는 페이로드를 방출하는 양상에 따라 크게 절단형 링커(cleavable linker)와 비절단형 링커(non-cleavable linker)로 나눌 수 있다. 절단형 링커는 일반적으로 리소좀 내의 효소 및 종양미세환경 내의 환경 등에 의해 링커가 잘리고 이후의 구조에서 전자 전달 과정을 통해 최종적으로 페이로드를 방출하는 메커니즘을 가진다.¹⁴⁾ 비절단형 링커는 별도의 생체 내 기전 혹은 환경에서 잘리지는 않지만, 생체 및 세포 내 단백 분해(proteolysis) 과정에 의해 항체가 잘리며 약물을 방출한다. 비절단형 링커를 사용할 경우 생체 내에서 굉장히 안정적이라는 장점이 있으나, 페이로드 방출이 단백분해 과정에 의존하기 때문에 최종적으로 관찰되는 페이로드가 페이로드 그 자체보다는 아미노산이 함께 붙어있는 형태로 관찰될 수 있다.¹⁵⁾ 각각의 링커는 장단점을 가지고 있기 때문에, 일면만 보고 어떠한 링커가 우수하다고 단언할 수는 없다.

링커는 타겟으로하는 암종의 특성과 사용하고자 하는 페이로드의 약효 및 화학적 구조 등을 종합적으로 고려하여 설계 및 선택하여야 한다.

최초의 항체-약물 중합체는 2000년에 허가받은 Mylotarg^TM (Gemtuzumab ozogamicin)이다. 이후 2011년까지는 허가받은 약물이 없었으나 Adcetris^TM (Brentuximab vedotin)와 Kadcyla^TM (Trastuzumab emtansine)가 각각 2011년과 2013년에 허가 받았다. 이후에 2019년부터 2022년 사이에 지금은 철회된 Blenrep^TM을 포함해 7개의 항체-약물 중합체가 허가를 받으며 항체-약물 중합체에 대한 제약 업계의 관심이 지대하게 높아졌다(Table 1).

Table 1 Types and Characteristics of FDA-Approved Antibody-Drug Conjugates as of October 2024

상품명	성분명	허가년도	타겟	항체	중합위치	링커	페이로드
Mylotarg	Gemtuzumab ozogamicin	2000/2017	CD33	IgG4	Lysine	Hydrazone	Calicheamicin
Adcetris	Brentuximab vedotin	2011	CD30	IgG1	Cysteine	MC-VC-PABC	MMAE
Kadcyla	Trastuzumab emtansine	2013	HER2	IgG1	Lysine	Thioether-MCC	DM1
Besponsa	Inotuzumab ozogamicin	2017	CD22	IgG4	Lysine	Hydrazone	Calicheamicin
Polivy	Polatuzumab vedotin	2019	CD79b	IgG1	Cysteine	MC-VC-PABC	MMAE
Padcev	Enfortumab vedotin	2019	Nectin-4	IgG1	Cysteine	MC-VC-PABC	MMAE
Enhertu	Trastuzumab deruxtecan	2019	HER2	IgG1	Cysteine	MC-GGFG	Dxd
Trodevly	Sacituzumab govitecan	2020	Trop-2	IgG1	Cysteine	CL2A	SN38
Blenrep (withdrawn)	Belantamab mafodotin	2020	BCMA	IgG1	Cysteine	MC-linker	MMAF
Zynlonta	Loncastuximab tesirine	2021	CD19	IgG1	Cysteine	PEG8 spacer-VA-PABC	PBD dimer
Tivdak	Tisotumab vedotin	2021	Tissue factor	IgG1	Cysteine	MC-VC-PABC	MMAE
Elahere	Mirventuximab soravtansine	2022	FRα	IgG1	Lysine	Sulfo-SPDB	DM4

항체-약물 중합체에 대한 관심과 이해가 깊어짐에 따라 항체-약물 중합체에서 개선 및 관리해야 할 여러 부분들이 제시되었다. 일반적으로 항체-약물 중합체는 다른 플랫폼의 의약품들과 비교하여 높은 이질성(heterogeneity)을 갖는다. 즉 같은 배치 내에서 생산된 약물 분자라 할지라도 다른 구조를 가지고 있는 경우가 있다. 특히 항체-약물 중합체 분자에서 하나의 항체에 붙어있는 약물의 개수를 의미하는 항체 대 약물 비율(Drug to Antibody Ratio, DAR) 값과 링커-페이로드의 중합 위치의 이질성이 항체-약물 중합체의 이질성에 크게 기여한다.¹⁶⁾ 또한 DAR 및 중합 위치의 이질성이 중요한 이유는 최종적으로 약동학 특성뿐만 아니라 유효성 및 안전성에도 영향을 미치는 것으로 알려졌기 때문이다.²⁵⁾ 이러한 흐름 속에서 균질한(homogeneous) 항체-약물 중합체를 생산하고자 하는 노력들이 있었다. 그중에서도 기존의 중합 방법을 넘어선 위치 특이적 중합 방법(site specific conjugation)들이 많이 제시되었다. 해당 고찰 문헌에서는 항체-약물 중합체 제조에 사용되었던 기존의 중합 방법들부터 최근에 사용되는 방법들까지 그 동향을 조사하여 정리하고자 한다.

항체-약물 중합체의 개발 초기에 많이 사용되던 방법 중 하나는 항체 표면의 lysine 잔기의 친핵성 NH2 amine group에 링커-약물을 중합시키는 방법이다. 현재까지 허가된 약물 중에는 Mylotarg^TM, Kadcyla^TM, Besponsa^TM 그리고 Elahere^TM가 lysine 잔기를 이용하여 링커-약물을 중합하였다.^19,20,21,22) Mylotarg^TM과 Besponsa^TM의 경우는 링커의 bifunctional 4-(4-acetylphenoxy)butanoic acid가 항체 표면에 노출된 lysine 잔기에 아마이드 결합을 통해 결합한다.¹⁹⁾ Kadcyla의 경우 succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) 링커의 carboxylate 부분이 lysine 잔기에 아마이드 결합한다.²³⁾ Elahere^TM의 링커는 세포 내 높은 GSH (Glutathione) 농도에 의해 잘리는 N-succinimidyl-4-(2-pyridyldithio)-2-sulfo butanoate (sulfo-SPDB) 링커로 마찬가지로 항체 표면의 lysine 잔기에 아마이드 결합한다.²⁴⁾ Lysine 서열은 amine 구조의 친핵성, 용매의 접근성, 최종 중합체의 안정성 등을 장점으로 과거부터 항체-약물 중합체 외에도 다양한 플랫폼의 생물학적 중합에 많이 이용되어왔다.²⁵⁾ 그러나 항체의 표면에 존재하는 lysine의 개수가 너무 많기 때문에, 이 중합 방법은 선택성이 떨어진다는 점이 늘 언급되었다. IgG 항체 표면에는 반응성 있는 lysine 잔기가 80개 가량 존재하는 것으로 알려져 있으며, 실제로 펩타이드 맵핑 데이터를 통해 확인했을 때 40개 정도의 lysine에서 중합된 형태의 펩타이드가 관찰되었다.^26,27) Lysine 중합은 중합의 위치와 개수 모두에서 선택성이 떨어진다. 즉, 평균 DAR 값이 4라고 알려진 항체-약물 중합체라고 할지라도 실제로는 DAR 값이 0인 분자부터 DAR이 8에 이르는 분자까지 다양한 형태로 존재하고 있을 뿐만 아니라, 같은 DAR 값을 가지는 분자라고 할지라도 서로 다른 lysine 잔기에 중합된 형태가 관찰될 수 있음을 의미한다(Fig. 3).²⁶⁾ 현재까지 사용되고 있는 항체-약물 중합체의 중합 방법 중에 lysine 잔기를 이용한 중합 방법은 가장 이질적인 방법으로 여겨지고 있다.

Fig. 3. The appearance and DAR profile of an ADC conjugated to the antibody surface lysine.

일반적으로 IgG1과 IgG4 항체는 총 4개의 사슬 간 이황화 결합을 가지고 있다.²⁸⁾ 이 사슬 간 이황화 결합을 dithiothreitol (DTT), Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) 등의 시약을 이용하여 환원시키면 하나의 이황화결합 당 2개의 free thiol 기가 형성되게 되며, 이러한 free thiol 기는 높은 친핵성을 가지기에 생물학적 중합에 사용될 수 있다. 일반적으로 cysteine의 thiol 기와 반응시키기 위해 사용되는 링커-약물은 maleimide 그룹을 포함하는 구조를 가지고 있다. Maleimide 구조는 thiol 그룹과 높은 반응성으로 Michael 첨가 반응을 통해 결합하는 특징을 가지고 있다.²⁹⁾ 현재까지 허가된 항체-약물 중합체 중 Adcetris^TM, Polivy^TM, Padcev^TM, Enhertu^TM, Trodelvy^TM, Zynlonta^TM 그리고 Tivdak^TM이 사슬 간 이황화결합을 환원시킨 뒤 얻은 cysteine에 링커-약물을 중합시켰다. 이러한 중합 방법은 lysine을 이용한 약물의 중합에 비해 더욱 높아진 선택성과 균일한 중합위치를 가졌다는 특징이 있다. 그러나 사슬 간 이황화결합이 환원되는 과정을 수반하기 때문에 항체 구조의 안정성에 대한 우려가 있으며, retro-Michael 첨가 반응에 따른 링커-약물의 생체 내 탈중합(deconjugation)에 대한 우려 역시 존재한다(Fig. 4).^30,31) 또한 해당 중합 방법이 lysine 중합에 비해 선택적이며 위치 특이적임에도 불구하고, 4개의 이황화결합이 모두 환원되어 중합된 분자부터(DAR=8) 이황화결합이 하나도 환원되지 않은 형태의 분자까지(DAR=0) 관찰되는 등 여전히 이질적인 혼합물이 생산된다(Fig. 5).³²⁾

Fig. 4. Scheme of Micahel addition reaction and retro Michael deconjugation.

Fig. 5. The appearance and DAR profile of an ADC conjugated to the cysteine that reduced from interchain disulfide bond of antibody.

앞서 언급한 중합 방법의 문제점들 중 위치특이성, DAR 값의 균일성 그리고 이황화 결합 환원에 의한 항체 구조 불안정성 등의 문제를 개선하고자 하는 방법의 일환으로 cysteine engineering 방법이 등장하였다.^33,34) 이는 항체에 존재하는 아미노산 중 일부를 cysteine으로 유전자 단계에서 치환하는 방법으로 주로 항원 결합에 영향을 주지 않는 것으로 알려진 항원결합부위 내 불변 부위를 치환한다.³⁴⁾ 처음 cysteine 치환 방법을 소개한 Genentech은 주로 중쇄의 114번 alanine을 cysteine (A114C)으로 치환하였고, 이렇게 치환 된 항체의 이름을 Thiomab이라고 명명하였다.³³⁾ 최초의 Thiomab이 등장한 이후 다양한 위치에 cysteine engineering이 시도되었는데, 몇몇 위치에 도입된 cysteine의 경우 링커-약물이 중합되었을 때 maleimide-thiol 간 결합의 안정성이 떨어지는 것이 확인되었다. 이러한 흐름에서 engineered cysteine의 위치가 항체-항원 간의 결합을 방해하지 않는 것이 중요할 뿐만 아니라 maleimide-thiol 결합의 안정성에도 영향을 미친다는 점이 중요하다.³⁵⁾ 일반적으로 생체 내에서 maleimide-thiol 결합 부위의 접근성이 높은 경우, albumin, GSH 등의 물질에 존재하는 free thiol 잔기로 인해 maleimide 교환 반응이 일어난다. 즉, 생체 내에서 DAR이 감소할 수 있음을 의미한다. 이는 항체-약물 중합체의 유효성을 감소시킬 뿐만 아니라, 독성을 야기할 우려도 있다. 이와 별개로 생체 내에서 maleimidethiol 결합의 maleimide 고리열림 가수분해(ring-opening hydrolysis) 반응도 일어날 수 있다. 이러한 고리열림 경향은 engineered cysteine의 국소전하가 양전하에 가까울수록 더 빈번하게 발생하는 것으로 관찰되었는데, 일단 한 번 고리열림 반응이 일어나게 되면 maleimide 교환 반응은 구조적으로 발생하지 않게 된다. 즉, 이것은 고리가 열림으로써 maleimide-thiol 연결이 안정해짐을 의미한다. 하지만 이와 대조적으로 Sussman 등은 고리 열림과 안정성 간에 관계성을 발견하지 못하였으며, 안정성은 약물의 소수성과 연관이 있다고 언급하였다.³⁶⁾ 그러므로 어떠한 위치에 중합하는 것이 정답이라고 말할 수는 없으며, 각 항체와 링커, 약물의 특성을 고려하여 cysteine engineering 위치를 선정하는 것이 중요하다. Cysteine engineering의 위치를 정할 때 고려할 사항에는 한 가지가 더 있는데 그것은 치환된 cysteine이 항체 내의 다른 cysteine 서열과 이황화 결합을 형성하는 소위 disulfide scrambling 현상이 일어나지 않는지 확인하는 것이다. 이러한 현상은 V110C, N297C, S298C 등의 치환에서 관찰된 바 있다.^33,34)

위와 같은 특성들이 어떠한 위치의 cysteine에 중합되느냐에 따라 달라진다는 것이 알려지며, cysteine engineering을 이용해 링커-약물을 중합할 때 engineering 위치를 전략적으로 결정하는 것이 요구되었다.^35,37) 요약하자면, 링커-약물 중합을 위해 cysteine engineering의 위치를 선정할 때에는 다음과 같은 사항들을 고려할 수 있다. 1) 항체-항원 간 결합에 대한 영향 2) thiol-maleimide 결합 간 안정성 3) disulfide scrambling에 의한 항체 구조 변성.

Engineered cysteine 중합 방법의 maleimide-thiol 간 결합의 불안정성에 대한 우려와 원치 않는 이황화결합의 형성 등을 극복 할 수 있는 하나의 방법으로 non-natural amino acid (nnAA) engineering을 통한 링커-약물의 중합 방법이 제안되었다.³⁸⁾ nnAA는 자연 상태에서 발견되지 않는 형태의 아미노산으로, noncanonical amino acid 등의 이름으로도 불리며, 세균 및 균류의 2차 대사산물로서 형성되거나 화학적으로 합성되는 아미노산을 의미한다. 본래 자연 상태에서 발견되는 아미노산은 selenocysteine, pyrrolysine 등의 예외적인 종류를 제외하면 20종으로 한정되어 있다. 이들 20종을 암호화하고 있는 코돈 61종을 제외한 3개의 종결 코돈에 대하여 상응되는 tRNA와 aminoacyl tRNA 합성효소를 이용하면 자연상태에 존재하지 않는 아미노산을 단백질에 삽입시킬 수 있음이 연구되었다.³⁹⁾ nnAA는 아미노산 잔기에 ketone, cyclopropene, bypyridine, alkynyl, azide 등 다양한 화학적 반응성이 있는 그룹을 가지고 있기 때문에 단백질에 nnAA 서열을 추가하거나 치환하여 다양한 기능을 갖도록 만들 수 있다.^40-43) 항체-약물 중합체의 항체 서열에 이렇듯 화학적 반응성을 지닌 nnAA를 삽입하여 위치특이적 중합에 활용할 수 있는데, 다만 항체 내 nnAA의 삽입 위치는 항체의 Fc 부분의 기능을 저해해서는 안 되며, 항원과의 결합, 면역원성 그리고 물성 등을 적절히 고려해야 한다. 이러한 물성은 링커와 페이로드의 종류에 따라서도 달라질 수 있기 때문에 항체의 기능뿐만 아니라 항체-약물 중합체의 전체적인 물성 관점에서도 최적화를 진행하는 것이 바람직하다.⁴²⁾

대표적인 nnAA에는 p-aceto phenylalanine (pAcF 혹은 pAF라고도 함), p-azido phenylalanine (pAzF), p-azidomethylphenylalanine (pAmF) 등이 있다.

pAcF 잔기의 ketone 그룹은 친전자체로 작용하여 hydrazides, alkoxyamine 그리고 semicarbazides 그룹 등과 반응하여 각각 hydrazone, oxime 그리고 semicarbazone 결합을 형성할 수 있다.^40,44) 특히나 항체-약물 중합체의 개발에는 pAcF와 alkoxyamine 그룹이 반응하여 형성되는 안정한 oxime 결합이 많이 사용된다(Fig. 6).^45-47) 해당 반응은 pH 4.0 정도에서 높은 반응성을 보이며 진행되는 것으로 알려져 있다.^45,47) Tian 등의 연구에 따르면 nnAA 삽입 부위를 제외하면 서열 및 구조가 동일한 항체와 페이로드를 사용했을 때 DAR이 더 높으며, 기존의 중합 방법을 이용한 항체-약물 중합체에 비해 설치류 모델에서 더 좋은 약효 및 약동학 특성을 보여주었다. 또한 cysteine engineering을 사용한 경우보다도 더 좋은 약효를 나타냈다.⁴⁶⁾ 아울러 이들은 cysteine engineering 시 cysteine 잔기 활성화를 위한 decapping 과정이 요구되며, 이 과정에서 항체의 구조에 필연적인 손상이 있을 수 있다고 언급했다.

Fig. 6. Oxime ligation between pAcF and alkoxyamine groups

pAcF를 이용한 중합을 통해 설계된 항체-약물 중합체 중에 현재 임상 시험이 진행되고 있는 대표적인 약물은 Ambrx사의 ARX788이다.^48,49) ARX788은 Trastuzumab의 서열에 중쇄 114번 alanine을 pAcF로 치환하였으며, non-cleavable 링커를 사용했다. 해당 약물의 평균 DAR은 1.9이며, 전임상에서 K adcy la와 비교하여 우수한 약동학 양상과 약효를 보였다.⁴⁹⁾ pAzF는 phenylalanine의 잔기의 페놀 그룹 para 위치에 azide 구조를 가지고 있는 nnAA이다.⁵⁰⁾ 기존에는 azide 그룹의 UV 의존성을 이용하여 단백질과 교차 결합을 하는 등의 용도로 사용되었으나, strain promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) 반응과 같은 구리 촉매를 사용하지 않는 클릭 화학(copper-free click chemistry)이 널리 알려지며 최근에는 약물 개발 등에 널리 사용되고 있다(Fig. 7).⁵¹⁾ 특히 해당 반응은 생물학적 직교성(bioorthogonal) 즉, 생체 내에 존재하는 다양한 잔기를 가지는 물질들과 상호작용하지 않는 특성을 가지기 때문에 약물 개발 등에 있어 가치가 매우 높다. Kern 등의 연구에서는 항 CD70 IgG1 항체의 중쇄 114번 알라닌을 pAzF로 치환한 뒤, 고리형 alkyne을 포함하는 링커-약물과 구리 촉매가 없는 조건에서 반응하여 1.9의 DAR 값을 갖는 항체-약물 중합체를 제조하였다.^52,53) 이와 유사하게 Brandish 등은 CD74을 타겟으로 하는 IgG4 항체의 114번 알라닌을 pAzF로 치환하여 링커-약물을 연결하였다. 이들은 연구에서 항 CD74 항체 외에도 여러 종류의 항체에 대하여 pAzF를 이용한 중합을 진행했으며, DAR은 1.5에서 1.9 사이로 관찰되었다.⁵⁴⁾

Fig. 7. Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) between pAzF and DBCO moiety.

pAzF 외에도 SPAAC 반응을 활용할 수 있는 잔기를 지닌 nnAA에는 Zimmermann 등의 연구에서 개발된 pAmF가 있다. 이들은 세포를 이용한 단백질 발현이 아닌 Open Cell Free Synthesis (OCFS) 방법을 이용하여 항체-약물 중합체에 사용할 항체를 개발했다.⁵⁵⁾ 하지만 OCFS를 이용할 경우 pAzF는 치환의 수율 및 중합이 성공적이지 않았으며, 이를 개선하기 위해 pAmF를 제안하였다. 이들은 Trastuzumab의 중쇄 서열 136번 serine을 pAmF로 치환하였으며, 그 결과 pAzF와 비교하여 더 높은 수율과 중합 효율이 나타났다. pAmF를 삽입하여 링커-약물을 중합한 항체-약물 중합체 중에 현재 임상 시험이 진행되고 있는 물질에는 Sutro사에서 개발 중인 Luveltamab tazevibulin (STRO-002)이 있다.^56,57) 해당 약물의 항체는 엽산 수용체를 타겟으로 하며 앞서 언급한 Cell free 단백질 합성으로 생산되었고, pAmF는 중쇄의 180번 tyrosine과 404번 phenylalanine 부위에 삽입되었다.⁵⁶⁾ 페이로드는 tubulin을 타겟으로 하는 hemiasterlin 유도체 SC209를 사용했으며, 링커의 DBCO (dibenzocyclooctyne) 구조와 pAmF의 azide 구조가 SPAAC 반응을 통해 중합되었다.이 약물은 3.95의 균질한 DAR 값을 가진다.

효소는 약물 중간체 합성 등의 공정에서 약물 개발에 오래전부터 사용되어왔는데, 항체-약물 중합체의 중합 과정에도 효소가 사용될 수 있다.⁵⁸⁾ 효소를 이용한 중합은 매우 빠르고 위치특이적이며, 온화한 조건에서 반응할 수 있다는 장점을 지닌다.⁵⁹⁾ 아래에는 효소를 이용하여 항체-약물 중합체를 중합시키는 방법 중에 실제로 임상 시험에서 사용되었거나 사용 중인 방법을 정리하였다.

Sortase A 기반 항체-약물 중합

Sortase A는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 발현하는 효소로 LPXTG 서열을 포함하는 단백질을 세포벽에 연결 하는 역할을 하는 Transpeptidase이다.⁶⁰⁾ Sortase A에 의한 transpeptidation은 Sortase A의 184번 cysteine이 LPXTG 서열의 threonine과 g ly cine 사이의 펩타이드 본드에 친핵성 공격을 가하면 g ly cine 이하의 서열이 잘리며 LPXT-Thioacyl 중간체가 형성된다. 이후 o ligo g ly cine 서열을 포함하는 폴리펩타이드 혹은 저분자 물질의 일차 아미노 그룹이 친핵체로 작용하여 g ly cine과 threonine 간의 펩타이드 결합이 형성된다(Fig. 8). Beerli 등은 Sortase A의 transpepdiase 역할을 이용하여 항체-약물 중합체 중합 기술인 SMAC-technology (sortase-mediated antibody conjugation technology)을 개발하였다.⁶¹⁾ 이들은 5개의 g ly cine을 연결한 maytansine과 MMAE를 중쇄 및 경쇄 C 말단에 spacer와 LPETG 서열을 발현하도록 한 항체와 높은 효율로 중합시키는데 성공하였다. NBE-002는 sortase A 기반 중합 기술을 이용하여 개발된 항체-약물 중합체로 2020년에 임상 1상에 진입하였으며, ROR1을 타겟으로 하는 약물이다.⁶²⁾

Fig. 8. Scheme of Sortase A-mediated antibody-drug conjugation

Microbial transglutaminase 기반 항체-약물 중합

Transglutaminase (Tgase)는 γ-glutamyl transferase 계열 효소에 속하는 단백질로 미생물부터 식물, 조류 등 다양한 생물체에 존재한다.⁶³⁾ 본래 생체 내에서 Tgase는 단백질의 번역 후 수정과정에 관여하는 효소이며, lysine의 1차 amine 그룹을 글루타민 잔기의 γ-carboxamide 그룹과 반응시켜 isopeptide bond를 형성하도록 한다.⁶³⁾ Tgase의 표적 단백질은 글루타민에 대한 선택성은 높지만, amine 그룹에 대해서는 유연한 기질 선택성이 있어 단백질의 변형 및 수정에 활용될 여지가 많다.⁶⁴⁾ 특히 미생물 유래 Tgase (MTgase)는 다른 Tgase들과 달리 조효소인 Ca²⁺에 대한 의존도가 낮으며, 글루타민 잔기를 글루탐산으로 변화시키는 deamidation 반응을 매개하는 경향이 적어 단백질의 의도적인 변형에 더욱 유리하다.⁶⁵⁾ 또한 MTgase의 높은 안정성과 pH에 대한 우수한 완건성 역시 다른 TGase들과 비교하여 산업적 이용 가능성을 더욱 높인다.⁶⁶⁾ 하지만 기존의 항체 서열에 존재하는 lysine 혹은 글루타민에 MTgase를 이용하여 약물 등을 중합시키는 경우 관찰되는 DAR 값이 0.3~0.5 정도로 낮아서 항체-약물 중합체의 활용에는 적절하지 않다.⁶⁷⁾ 그러나 N297Q 돌연변이가 일어나서 aglycosylation된 항체에서는 중쇄의 295번 글루타민과 297번 글루타민에 선택적으로 효소 반응이 일어나 4의 DAR 값을 가질 수 있음이 보고되었다.⁶⁸⁾

기존의 서열에 존재하는 글루타민을 활용하는 것이 아니라 앞선 Sortase A를 이용한 사례와 유사하게 MTgase에 의해 인식될 수 있는 glutamine tag인 LLQG 등의 서열을 유전적으로 삽입시켜 MTgase의 기질로 활용하는 방법도 있다(Fig. 9).⁶⁹⁾ Strop과 그의 연구진들은 90곳 이상의 위치에 LLQG tag를 삽입하여 중합 양상을 확인하였으며, 서열 말단 위치를 포함한 12곳의 위치에서 우수한 중합 양상을 확인하였다. 이처럼 Glutamine tag의 위치는 항체 서열의 말단 부분 외에도 내부 서열 사이에 tag를 삽입하더라도 MTgase에 의해 인식될 수 있다는 장점이 있다.⁶⁹⁾

Fig. 9. Scheme of MTgase-mediated antibody-drug conjugation

Formylglycine-generating 효소 기반 항체-약물 중합

Formylglycine (FGly)은 type 1 sulfatase의 활성 자리에서 발견되는 구조로 cysteine 혹은 세린의 번역 후 수정 과정에서 Formylglycine-generating enzyme (FGE)에 의하여 형성된다.⁷⁰⁾ FGE는 CxPxR 서열을 기질로 cysteine 잔기를 FGly로 변화시키는 역할을 하며, 특히 해당 서열 뒤에 xxxLTGR 서열을 갖는 경우 효소 반응이 크게 개선되는 것으로 알려졌다.⁷¹⁾ 특히 Mycobacterium tuberculosis의 FGE는 더 넓은 기질특이성을 가지기 때문에 의약품 개발 등에 대한 활용 가능성이 더욱 높다.⁷²⁾ FGly의 aldehyde 잔기는 친전자체로 작용하여 h y drazine 혹은 aminoxy 잔기를 가지는 화합물과 산성 조건에서 반응하여 hydrazone 혹은 oxime 생성물을 만들어 낼 수 있다.⁷³⁾ 이때 oxime 결합은 중성 조건에서 반응시키기 위해 aniline 등의 촉매가 필요하고, hydrazine은 중성 조건에서도 잘 반응할 수 있으나 평형상수가 낮아 지나치게 과량의 hydrazine을 요구한다는 단점이 있다.⁷⁴⁾ 이에 Agrawal과 그의 동료들은 Pictet-Spengler 반응을 응용하여 alkylhydrazine을 FGly의 aldehyde 그룹과 반응시키는 hyrazino-Pictet-Spengler (HIPS) ligation 반응을 발견하였다(Fig. 10).⁷⁴⁾ 이후 Drake와 그의 동료들은 FGly과 링커-약물의 HIPS 반응을 이용하여 항체-약물 중합체를 제조하였으며, 항체 서열 내에서 a ldehy de t ag의 적절한 위치를 탐색하였다.⁷⁵⁾ 8개의 중합 위치 후보군을 다양한 조건에서 비교하였는데, 중쇄의 C 말단에 aldehyde tag를 삽입했을 때 가장 우수한 물성을 보였으며, Kadcyla^TM와 비교하여 랫드에서 우수한 안전성을 보였다.⁷⁵⁾ 글로벌 CDMO Catalent는 FGE 기반 항체-약물 중합체 중합 기술 SMARTag^TM을 이용한 항체-약물 제조 서비스를 제공한다. SMARTag^TM 기술을 이용해서 개발된 항체-약물 중합체에는 Triphase accelerator에서 개발 중인 TRPH-222가 있다. TRPH-222는 비교적 높은 임상 시험 투여 용량인 10 mg/kg에서도 다른 항체-약물 중합체에서 빈번하게 관찰되는 부작용의 빈도가 높지 않았다.⁷⁶⁾

Fig. 10. Scheme of the formylglycine genereating enzyme (FGE) mediated conjugation method and hydrazino-Pictet-Spengler (HIPS) ligation reaction.

Isoprenoid transferase 기반 항체-약물 중합

Prenylation은 일부 단백질에서 일어나는 비가역적인 번역 후 수정 과정으로 farnesylation과 geranylgeranylation 등의 반응이 있다.⁷⁷⁾ Prenylation을 매개할 수 있다고 알려진 효소에는 F arnesy ltranferase (FTase), geranylgeranyltransferase type 1,2 (GGTase-I, GGTase-II)가 있다. FTase와 GGTase-I은 각각 15개의 탄소로 이루어진 farnesyl isoprenoid 그룹 혹은 20개의 탄소로 이루어진 geranylgeranyl isoprenoid 그룹을 cysteine 잔기에 부착시키는 역할을 한다. 특히 이 반응은 “CaaX box”라고 알려진 C 말단에 위치한 서열을 인식하여 발생한다(Fig. 11).^77,78) ‘CaaX’에서 ‘C’는 cysteine, ‘aa’는 지방족 잔기를 가진 두 개의 아미노산, ‘X’는 기질의 종류에 따라 특이적으로 반응할 수 있는 임의의 아미노산을 의미한다.⁷⁸⁾ Prenylation 반응 이후에 일반적으로 cysteine 이하의 서열은 잘리기 때문에 CaaX 서열은 단백질의 C 말단에 존재한다.⁷⁷⁾ 김학성 교수 연구진은 2015년 다수의 lysine 서열을 갖고 있는 repebody 단백질의 C 말단에 CaaX body로 CVIM 서열(Cys-Val-Ile-Met)을 삽입시킨 뒤, FTase를 이용하여 geranyl ketone pyrophosphate (GKPP) 구조를 붙였다.⁷⁹⁾ 이후 전이된 GKPP의 ketone 관능기의 반응성을 이용하여 aminooxylted MMAF를 페이로드로 하는 링커-약물을 oxime 결합을 통해 중합시켰다(Fig. 12). 2024년 현재 임상 개발 단계에 있는, prenylation 후 oxime ligation을 이용한 약물 중 하나로 리가켐바이오사이언스와 포순제약이 함께 개발하고 있는 FS-1502 (LCB14)가 있다.⁸⁰⁾ 해당 약물은 항 HER2 항체인 trastuzumab의 C 말단에 CaaX 서열을 삽입한 뒤 앞서 설명한 과정대로 약물을 중합하였으며, 2의 잘 조절된 DAR 값 및 분포를 가진다. 또한 설치류 및 비인간 영장류에서 바람직한 생체 내 분포 및 약동학 양상을 나타내었다.^81,82) 전임상결과와 더불어 FS-1502는 임상 1상 시험에서도 양호한 안전성 및 유효성 프로파일을 보였다.⁸⁰⁾

Fig. 11. Scheme of the FTase and GGTase mediated prenylation of CaaX moiety

Fig. 12. Scheme of FTase-mediated antibody-drug conjugation after CaaX sequence insertion.

앞서 설명한 engineered cysteine 방법부터 nnAA 삽입 중합 방법 그리고 효소 기반의 중합 방법들은 모두 위치특이적이며 균질한 항체-약물 중합체의 생산을 가능하게 한다. 이는 내재된 lysine 혹은 cysteine을 이용하는 기존의 중합 방법들을 훌륭하게 보완하였지만, 모두 유전자 단계에서 유전자 및 아미노산 서열을 조작하는 과정이 필요하다. 이러한 조작을 거치면 서열 변화에 따른 항체의 결합력 및 동태의 변화를 최소화하기 위해 추가로 최적화 과정이 필요할 수도 있고. 아미노산 서열 등의 변경에 따른 면역원성도 무시할 수 없다.⁸³⁾ 때문에 최근에는 항체-약물 중합체의 개발에 유전공학 비의존적이면서 위치특이적인 중합 기술들이 개발되고 있다.

Glycan remodeling을 이용한 항체-약물 중합

모든 단일 클론 항체 중쇄의 297번 서열 부근의 아스파라긴은 비록 각 항체 분자마다 당의 구조는 다를지라도 당화되어있다.⁸⁴⁾ 항체에서 당의 구조는 Fc gamma 수용체와의 결합능에 영향을 주어, ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 등에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다.⁸⁵⁾ 그러나 항체-약물 중합체의 경우 약효는 최종적으로 페이로드에 의해 결정되며, ADCC 혹은 CDC (complement-dependent cytotoxicity) 등 항체의 역할에 의한 작용 기전이 미치는 영향은 미미하다.⁸⁴⁾ 이에 Wijdeven과 그의 동료들은 CHO 세포를 이용해 생산된 항체의 중쇄 297번 아스파라긴 당의 핵심 구조인 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)과 1개 혹은 0개의 Fucose 구조를 제외한 부분을 Endoglycosidase로 제거하는 동시에, glycosyl transferase를 이용해 항체에 남아있는 핵심 당 구조에 UDP-GalNAc-N3 구조를 중합 시켜 glycan remodeling을 진행하였다. 이후 항체에 중합된 azide기와 Cyclooctyne 구조를 갖는 링커-약물을 SPAAC 반응을 통해 중합시킴으로써 유전자 변형 없이, 위치 특이적으로 균질한 DAR 값을 갖는 항체-약물 중합체를 제조하는데 성공하였다(Fig. 13).⁸⁶⁾ 이와 같은 중합 방법은 Synaffix사의 Glycoconnect^TM 기술로 ADCT-601 등 다양한 항체-약물 중합체의 개발에 적용 중에 있다.^87-89)

Fig. 13. Scheme of GlycoConnect^TM mediated conjugation method.

Fc 부위 친화성 펩타이드를 이용한 항체-약물 중합

Protein A, G 그리고 L을 비롯하여 항체 구조에 친화성을 갖는다고 알려진 다양한 단백질 및 펩타이드들이 있다.^90-92) RGNCAYHKGQLVWCTYH 서열의 펩타이드는 항체의 Fc 위치에 친화성을 갖는 것으로 알려졌다.⁹³⁾ 이에 Ajinomoto 사 소속 연구원들은 해당 펩타이드의 lysine 잔기에 친전자성 succinimidyl propionate와 이황화결합을 포함하는 화학 구조를 연결한 뒤, 항체에 중합시키는 AJICAP^TM 기술을 제안하였다(Fig. 14).^93,94) 설명한 바와 같이 친전자성 그룹을 가지도록 설계된 펩타이드는 서열의 Fc 그룹과의 친화성에 의해 항체의 Fc 영역 근처에 위치하게 된다. 이후 succinimidyl propionate를 포함한 친전자성 구조가 항체 중쇄의 248번 lysine 잔기에 가깝게 위치하며 공유결합한다.⁹⁵⁾ 이후 결합된 펩타이드 구조의 이황화 결합을 환원시키면 free thiol기가 형성되며 링커-약물 간의 결합이 가능해진다.⁹³⁾ AJICAP^TM 기술을 이용하여 중합된 항체-약물 중합체는 기존의 cysteine 잔기에 중합된 항체-약물 중합체와 비교하여 생체 내에서 안정적인 중합 상태를 유지하였으며, 안전성 프로파일에서도 우수함을 보였다.⁹⁶⁾ 이와 같은 AJICAP^TM 중합 기술의 우수성에도 불구하고, 중합 과정 중 이황화 결합 환원 단계에 사용되는 TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) 등의 시약이 원치 않는 사슬 간 이황화 결합을 환원시키면 추후 이를 복구하기 위한 부분 산화 과정에서 disulfide bond scrambling과 같은 문제가 발생할 수 있다. 또한 NHS ester 그룹의 높은 반응성으로 인해 원치 않는 생성물이 나타나거나 상대적으로 많은 응집 체가 형성되는 등의 한계점이 지적되었다.^97,98) 이에 2세대 AJICAP^TM 기술에서는 기존의 단점을 극복하였을 뿐만 아니라 288번 lysine 잔기에도 중합이 가능한 펩타이드 서열을 추가로 발견하며, 248번 lysine에 국한되었던 중합 위치를 확장하였다(Fig. 15).⁹⁸⁾

Fig. 14. Scheme of AJICAP^TM 1st generation technology mediated conjugation method.

Fig. 15. Scheme of AJICAP^TM 2nd generation technology mediated conjugation method.

AJICAP^TM 기술 외에도 Fc 부위에 친화성을 지닌 펩타이드를 이용한 항체-약물 중합체의 중합 기술로 AbClick^® 기술이 있다.⁹⁷⁾ AbClick^® 기술은 Abtis 사에서 개발한 중합 기술로 AJICAP^TM 기술과 마찬가지로 중쇄 248번 lysine 잔기에 링커를 먼저 중합시킨다. Fc 친화성을 지닌 펩타이드 덕분에 중합시키고자 하는 5-norbornene-2-carboxylic acid thioester 기를 가진 링커를 lysine 잔기와 가깝게 위치시키게 되면, S to N a cy l 전이 반응에 의해 링커가 norbornene 구조를 가진 채 항체에 중합된다. 이후, norbornene 구조와 페이로드를 포함한 링커-약물이 Diels-Alder 반응에 의해 최종적으로 결합하게 된다(Fig. 16).⁹⁷⁾ 최근에는 norbornene 구조 외에도 Azide 기를 포함하는 링커를 먼저 중합한 뒤 SPAAC 반응을 통해 링커-약물을 중합하는 기술 역시 AbClick^® 기술로 개발되었다(Fig. 17).

Fig. 16. Scheme of AbClick^® technology mediated conjugation via Diels-Alder click reaction.

Fig. 17. Scheme of AbClick^® technology mediated conjugation via SPAAC reaction.

항체-약물 중합체의 발전이 계속되며 항체-약물 중합체에 대한 주요 품질 특성(Critical Quality Attribute, CQA) 항목 역시 개발에 주요한 고려 사항이 되었다. 특히, DAR과 중합 위치 규명은 다수의 문헌에서 CQA로서 그 중요성이 강조된 바 있다.^23,99,100) 최근에는 항체-약물 중합체에 대한 개발이 가속화되고 이해가 깊어짐에 따라 더욱 균질한 DAR 값과 중합 위치의 일관성이 요구되고 있다. 항체-약물 중합체에서 사용되는 중합 방법은 DAR과 중합 위치 품질 특성에 밀접한 연관을 갖는다. 그러므로 항체-약물 중합체의 개발에 있어 사용할 중합 방법을 결정하는 것은 목표로 하는 약물의 프로파일을 달성함에 핵심적인 단계가 될 수 있다. 중합 방법은 단순히 이 문헌에서 설명한 방법들에 국한되지 않으며, Disulfide re-bridging 방법 등 새로운 방법이 계속해서 등장하고 있다.¹⁰¹⁾ 그러므로 중합 방법에 대한 지속적인 동향 파악은 목표 약물 프로파일을 달성하는데 도움이 될 것으로 사료된다.

본 연구는 2024년도 식품의약품안전처의 연구개발비(23202MFDS148)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Jeong-hyeon Lim : Graduate student

Seo-jin Park : Graduate student

Sangsoo Hwang : Graduate student

Juwon Lee : Undergraduate student

Hyunjin Cho : Undergraduate student

Young G. Shin : Professor