황반변성(Age-related macular degeneration, AMD)은 망막의 중심부에 위치하는 황반(macular)이라는 부위가 변성됨에 따라 시력에 이상이 생기는 질병이다.¹⁾ 증상으로는 사물이 왜곡되어 보이는 변형시(metamorphopsia)를 시작으로 점차 시야의 중심이 어둡거나 보이지 않게 되는 중심암점(central scotoma)이 나타나고 심한 경우 시력을 아예 상실하게 되기도 한다.²⁾ 통계에 따르면, 노화가 유병률에 가장 밀접한 관련을 보이며 이외에도, 성별, 유전, 인종, 흡연, 잦은 햇빛 노출 등이 AMD 발병에 연관되는 것으로 알려졌다.³⁾

병변은 크게 건성(dry type)과 습성(wet type)으로 나눠진다.⁴⁾ Wet AMD는 맥락막 아래에 비정상적인 신생혈관이 생성되는 경우로, 전체 AMD 환자의 약 10%를 차지한다. 병의 진행 속도는 빠른 편이고 신생혈관으로부터 혈액이 삼출 되면서 돌이킬 수 없는 시력 손상을 일으킨다.⁵⁾ 전체 AMD 환자의 약 90%를 차지하는 건성황반변성(dry AMD)은 망막 색소 상피세포에 drusen 이라는 노폐물이 관찰되는 것을 특징으로 한다.⁶⁾ Drusen은 나이가 들수록 손상되는 광수용체(photoreceptor)의 잔존물로서 콜레스테롤, 지질, 각종 단백질과 황갈색 색소인 lipofuscin으로 구성되어 있다.⁶⁾ Dry AMD는 병의 진행 속도가 느리고 시력 손상이 심하지 않지만, geographic atrophy가 나타나면서 급격하게 시력 저하가 일어날 수 있고 wet AMD로도 이어질 수 있다.⁷⁾ 전 세계가 고령 사회로 접어듦에 따라 노인성 AMD의 발병률 또한 가파르게 증가하고 있지만, 명확한 발병 기전이 규명되지 않아 현재 dry AMD에 대한 마땅한 치료제가 개발되지 못해 루테인, 지아잔틴, 오메가3 등 전통적으로 눈건강에 도움을 준다고 알려진 기능성 식품류에 의존하고 있는 실정이다.⁸⁾

많은 연구자들이 lipofuscin의 주요 발색단 중 하나인 Nretinylidene-N-retinylethanolamine (A2E)에 주목하고 있다. A2E는 visual cycle에 주된 역할을 담당하는 vitamin A의 불용성 대사산물로서, 그 자체로도 세포독성을 가지지만 청색광(blue light, BL)에 의해 산화되면 망막 세포에 심각한 광독성을 유발하는 것으로 알려져 있다.^9,10) 청색광은 가시광선 영역에 속하지만 자외선에 가까운 파장 특징으로 다른 가시광선에 비해 높은 에너지를 나타낸다. 최근 스마트 기기의 광범위한 사용 증가로 인해 BL이 인체에 미치는 영향에 대한 재평가가 이루어지고 있다.¹¹⁾

본 연구에서 우리는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)를 이용하여 망막 퇴행성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 가능성에 대해 알아보고자 하였다. 이를 위하여 SSRIs가 망막 색소 상피 세포에서 자가포식(autophagy)에 미치는 영향과 세포내 축적된 A2E를 분해하는 기능이 있는지를 확인하였다.

시약 및 재료

FDA로부터 승인을 받은 6종의 SSRIs (citalopram, escitalopram, fluoxetine, fluvoxamine, paroxetine, sertraline)은 Sigma-Aldrich (Missouri, USA)에서 구입하였다. N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E)는 Key Synthesis LLC (Philadelphia, PA, USA)에서 구입하였다.

세포 배양 및 세포 생존율 측정

인간망막색소상피세포주(ARPE-19)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 세포는 37°C, 5% CO₂ 환경에서 10% FBS (Gibco Island, NY, USA)와 100 U/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin (HyClone^TM, Logan, UT, USA)이 첨가된 DMEM/F-12 (Welgene, Daegu, Korea)에 배양하였다. 세포 생존율은 IncuCyte Zoom imaging system (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)으로 측정하였다.¹²⁾

자가포식 활성 측정

자가포식 활성은 이전에 보고된 바와 같이 LC3-II 형성 및 p62(S349) 인산화 수준의 변화를 측정하여 평가하였다.¹⁰⁾ ARPE-19 세포를 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 세포에 6시간 동안 10μM의 시료만 단독 처리하거나 10μM의 시료와 4 nM의 bafilomycin A1을 동시 처리하였다. Autophagic flux는 대조군 또는 각각의 SSRI 존재하에 bafilomycin A1 처리에 의한 LC3-II 수준의 증가 정도 (Net-LC3-II flux)로 측정되었다.¹⁰⁾

웨스턴 면역블롯 분석

ARPE-19 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 radio-immunoprecipitation assay (RIPA) buffer (50mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2mM ethylenediaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulfate, 1% sodium deoxycholate, 1% NP-40)를 사용하여 세포 용해물을 얻었다. 각 세포 용해물은 12% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동을 하였으며 분리된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 흡착 후 5%의 skim milk가 함유된 TBST (Tris-Buffered Saline+Tween 20)로 blocking 하였다. Western blotting에 사용된 항체는 다음과 같다. LC3-II, p-p62, anti-rabbit IgG (Cell Signaling Technology, Massachusetts, USA), β-actin, m-IgGκ BP-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA).

망막색소상피세포내 A2E 함량

ARPE-19 세포를 96-well white plate에 5×10³ cells/well로 분주한 뒤 24시간 동안 배양시켰다. 그 후, 형광단이 표지된 A2E (A2E-BDP, 20 μM)를 세포에 처리하여 24시간 동안 축적시켰다.¹³⁾ A2E-BDP가 축적된 ARPE-19 세포에 10-50 μM의 citalopram 또는 fluvoxamine을 24시간 동안 처리하였다. RIPA buffer로 세포를 용해시킨 후 세포 내 A2E-BDP의 함량을 fluorescence microplate reader (VICTOR^TM X3; PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA)으로 485 nm (excitation) 및 535 nm (emission)에서 형광광도법으로 측정하였다.

통계분석

모든 통계 결과는 GraphPad Prism 8.0.2 (GraphPad, San

Diego, CA)을 사용하여 분석되었으며, mean±SD로 나타냈다. 각 약물처리군의 측정치는 대조군 측정치의 비율로 나타냈다. 각 그룹 간의 유의미한 차이는 one-way analysis of variance(ANOVA) 및 post-hoc으로서 Dunnett’s multiple comparisons test를 이용하였으며 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

SSRIs의 RPE 세포에 대한 독성 평가

먼저 ARPE-19 세포주에 대한 SSRIs의 세포독성을 평가하였다. 각각의 SSRIs를 10-50 μM 농도로 ARPE-19 세포에 3일 동안 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. Citalopram, escitalopram, fluvoxamine은 시험에 사용한 모든 농도에서 유의미한 세포 독성을 나타내지 않았지만, fluoxetine, paroxetine, sertraline은 20 μM 이상의 농도에서 통계적으로 의미 있는 세포 독성을 나타내었다(Fig. 1). 이 결과를 바탕으로, 실험에 사용할 SSRIs의 최고 농도를 10μM로 결정하였다.

Fig. 1. Cytotoxicity of SSRIs in ARPE-19 cells.
Cytotoxicity of SSRIs in ARPE-19 cells was assessed by IncuCyte Zoom imaging system. ARPE-19 cells were seeded in a 24-well plate at a density of 1×104 cells/well and incubated for 24 h. Cells were treated with 10-50 μM SSRIs for 3 days. The results are presented as mean±SD (n=9).

SSRIs에 의한 RPE 세포의 자가포식 활성화

SSRIs의 하나인 fluoxetine은 macrophage에서 NLRP3-ASC inflammasome 활성을 막음으로써 RPE세포의 변성을 지연시키며,¹⁴⁾ astrocyte에서 자가포식을 유도할 수 있음이 선행연구를 통해 보고되었다.¹⁵⁾ 자가포식이란, 세포 내 손상된 소기관 또는 구성 요소를 분해하고 이를 통해 스트레스를 낮추고 에너지를 재생산하는 세포의 rebuilding 작용이다. 이 기능은 세포 항상성 유지와 세포 생존을 촉진하는 데 중요하다. 자가포식을 유도하여 질병을 치료하는 시도가 많이 이루어짐에 따라 본 연구에서 SSRIs가 RPE (retinal pigment epithelial) cell에서 자가포식을 유도하는 기능이 있는지를 조사하였다. 먼저 ARPE-19 세포에 SSRIs를 5μM과 10μM 농도로 6시간 동안 처리한 후 자가포식 활성화의 대표적인 마커인 LC3-II 형성의 변화를 관찰하였다. 추가적으로 Ser349 잔기가 인산화 된 p62 단백질 (p-p62(S349)의 증가를 통한 오토파지 활성화 효과를 항 p-p62(S349) 항체를 이용하여 Western blotting 방법으로 측정하였다. 세포 내 p-p62(S349) 수준의 증가는 autophagosome 형성을 나타내는 주요 지표 중의 하나로 알려진 바 있다.¹⁶⁾ 각 실험에서 rapamycin은 positive control로 사용되었다. 대부분의 SSRIs가 LC3-II 형성 및 p62 단백질의 인산화 수준을 농도 의존적으로 증가시켰다(Fig. 2). 추가로, autophagosome과 lysosome의 융합을 차단함으로써 자가포식을 막는 역할을 하는 bafilomycin A1을 이용하여 autophagic flux를 확인하였다. Bafilomycin A1을 단독 처리했을 때에 비하여 bafilomycin A1과 SSRIs을 함께 처리했을 때 LC3-II 단백질의 수준이 현저히 증가하였으며 이러한 결과는 SSRIs이 RPE 세포에서 autophagic flux를 활성화하는 것을 나타낸다(Fig. 3). Sertraline은 HUVECs에서 AMPK-mTOR signaling을 통해,¹⁷⁾ fluoxetine은 non-small cell lung cancer cell에서 ATF4-AKTmTOR signaling을 통해 자가포식을 유도한다고 알려졌다.¹⁸⁾ 또한, Fluvoxamine은 NSC34 cell에서 TFEB을 핵으로 전위시킴으로써 자가포식을 유도한다고 보고되었다.¹⁹⁾ 하지만 SSRIs에 의한 자가포식 유도 기전은 아직 명확하지 않다. RPE 세포에서 SSRIs의 자가포식 유도는 위의 기전을 포함하여 다양한 nonmTOR pathway의 관련 가능성도 있을 것으로 생각된다.

Fig. 2. Activation of autophagy by SSRIs in ARPE-19 cells.
(A) ARPE-19 cells were seeded in a 6-well plate at a density of 1×10⁵ cells/well and incubated for 24 h. Cells were treated with SSRIs for 6 h. Rapamycin was used as a positive control. (B&C) The results are presented as mean±SD (n=3). Cit, Citalopram; Esc, Escitalopram; Fluo, Fluoxetine; Fluv, Fluvoxamine; Par, Paroxetine; Ser, Sertraline; Rapa, Rapamycin.

Fig. 3. Increase of autophagic flux by SSRIs in ARPE-19 cells.
ARPE-19 cells were seeded in a 6-well plate at a density of 1×105 cells/well and incubated for 24 h. Cells were treated with SSRIs or co-treated with 10 μM SSRIs and 4 nM bafilomycin A1 for 6 h. Net-LC3-II flux was measured as the increased level of LC3-II levels by bafilomycin A1 treatment in the presence or absence of SSRIs. The results are presented as ±SD (n=3). *p<0.05, ***p<0.001 vs CTR. CTR, control; Cit, Citalopram; Esc, Escitalopram; Fluo, Fluoxetine; Fluv, Fluvoxamine; Par, Paroxetine; Ser, Sertraline.

RPE 세포에서 citalopram과 fluvoxamine의 A2E 제거 효과

Dry AMD 환자에서 특징적으로 관찰되는 drusen에는 황갈색 색소인 lipofuscin이 포함되어 있다. Lipofuscin의 주요 발색단이 A2E라는 것이 밝혀졌고 A2E가 광독성을 일으킨다는 결과를 바탕으로 많은 연구자들이 A2E를 제거하고자 시도하였다. 우리는 SSRIs들이 세포내 A2E의 수준을 감소시킬 수 있는지 조사하였다. ARPE-19 세포에 형광표지 된 A2E (A2E-BDP)를 처리하여 축적시킨 후,¹²⁾ citalopram 또는 fluvoxamine을 농도 별로 24시간 동안 처리하였다. 각 세포에 RIPA buffer를 처리하여 얻은 세포용해액을 fluorescent microplate reader를 이용하여 형광 수준을 측정하였다. Citalopram과 fluvoxamine 모두 농도 의존적으로 형광 수준을 줄였으며 이와 같은 결과는 citalopram과 fluvoxamine 이 RPE 세포 내에 축적된 A2E를 감소시킨다는 것을 나타낸다(Fig. 4A & B). SSRIs에 의한 자가포식 유도와 A2E 제거 기능을 제시하였지만, 이 두 기전 사이의 관련성은 아직 명확하지 않다. 자가포식 필수 단백질의 knockdown이 SSRIs의 A2E 제거능에 영향을 미치는지 확인하는 등의 추가적인 연구를 통해 보다 명확한 결론을 내릴 수 있을 것으로 보인다.

Fig. 4. Reduction of A2E level by citalopram and fluvoxamine in ARPE-19 cells.
(A&B) ARPE-19 cells were seeded in a 96-well white plate at a density of 5×10³ cells/well and incubated for 24 h. Cells treated with 20 μM A2E-BDP for 24 h. After that, cells were treated with citalopram or fluvoxamine for 24 h. After adding 100 μL of RIPA buffer per well, the fluorescence value was measured at 485 nm/535 nm (excitation/emission). The results are presented as mean±SD (n=3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs no-treatment control.

본 연구는 dry AMD 치료제로 SSRIs의 활용 가능성을 조사하기 위해 인간망막색소상피세포인 ARPE-19에서 SSRIs에 의한 자가포식 활성화 여부와 A2E 제거능을 평가하였다. 시험에 사용한 6종의 SSRIs (citalopram, escitalopram, paroxetine, sertraline, fluoxetine 및 fluvoxamine) 모두는 세포독성을 보이지 않는 농도에서 ARPE-19 세포주에서 자가포식을 유도하는 것으로 확인되었다. 이들 중 citalopram 및 fluvoxamine은 RPE 세포에서 축적된 A2E를 제거하는 효능을 갖는 것으로 확인되었다. 본 연구는 SSRIs가 RPE 세포에서 자가포식 활성화 및 A2E 제거능이 있음을 보여줌으로써 새로운 dry AMD 치료 가능성을 제시한다.

이 논문은 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (2021R1A2C1011132).

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Chae Young Shin : Graduate student

Kwang Won Jeong : Professor