생물학적제제란 생물체에서 유래된 물질이나 생물체를 이용하여 생성시킨 물질을 함유한 의약품으로서 물리적•화학적 시험만으로는 그 역가(potency)와 안전성을 평가할 수 없는 백신, 혈장분획제제 및 항독소 등을 말한다.¹⁾ 생물학적제제 중 혈장분획제제는 사람 혈장을 원료로 사용하여 분획 공정을 거쳐 만들어진 의약품으로, 면역글로불린, 알부민 및 응고인자 등이 포함되며, 세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 선천성•후천성 면역결핍증, 유전적 단백질 장애 및 혈우병 등의 치료에 사용되는 혈장분획제제를 필수의약품으로 지정하여 관리하고 있다.²⁾ 전 세계 국가규제기관(national regulatory authority)에서는 생물학적제제가 허가 후 시중에 유통되기 전에 국가에서 제품의 품질을 직접 확인하는 국가출하승인(national lot release) 제도를 시행하고 있으며, 한국의 국가규제기관인 식품의약품안전처(Ministry of Food and Drug Safety, MFDS)에서는 백신, 혈장분획제제, 항독소, 보툴리눔제제 및 튜베르쿨린제제를 국가출하승인의약품의 범위로 지정하고 있다.^3,4) 국가출하승인의약품은 각 제조번호마다 원료부터 완제의약품까지의 제조 및 품질관리 정보를 기록한 제조 및 품질관리요약서를 평가하며, 완제의약품의 주요 안전성•유효성 관련 품질관리 시험항목에 대한 검정시험을 수행하여 출하 승인 여부가 결정된다. 국가출하승인의약품인 혈장분획제제 중 B형 간염 사람 면역글로불린을 포함한 면역글로불린제제의 역가는 B형 간염 표면항원(hepatitis B surface antigen, HBsAg) 항체의 역가를 지표로 설정하여 측정하고 있으며, 식품의약품안전처 고시인 ｢생물학적제제 기준 및 시험방법｣의 제제별 각조에 따라 B형간염표면항원항체가시험을 수행한다.⁵⁾ B형간염표면항원항체가시험은 효소면역학적 방법을 사용하여 B형 간염 사람 면역글로불린 표준품과 비교하여 제품의 B형 간염 표면항원 항체 역가를 측정토록 수재되어 있으며, 우리나라에서는 효소면역학적 방법 중 전기화학발광면역분석법(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)을 사용하여 국가규제실험실(national control laboratory)의 국가출하승인 검정시험 및 제조사 품질관리시험을 수행하도록 조화되어 있다. 최근 WHO에서는 생물학적제제의 품질관리시험을 수행하는 국가규제실험실의 국제표준화기구(International Organization for Standardization, ISO)/국제전기기술위원회(International Electrotechnical Commission, IEC) 17025 인정을 권고하는 추세이며,⁶⁾ 이에 한국의 국가규제실험실인 식품의약품안전평가원에서는 백신 및 혈장분획제제의 주요 품질관리시험에 대해 한국인정기구(Korea Laboratory Accreditation Scheme, KOLAS)로부터 대분류 생물학적시험, 중분류 미생물 분야로 ISO/IEC 17025 인정을 받았다. ISO/IEC 17025는 시험 및 교정기관의 적격성에 대한 일반 요구사항으로, 시험결과를 측정값으로 표현하는 경우 측정값에 대한 불확도 추정을 요구하고 있다. KOLAS-G-001 지침에 따르면, 측정불확도란 사용된 정보를 기초로 측정량에 대한 측정값의 산포 특성을 나타내는 음이 아닌 파라미터를 말하며, 측정결과의 신뢰수준을 나타내는 방식으로 현재 널리 사용되고 있다.⁷⁾ 이는 생물학적제제의 품질관리시험 분야로도 확대되고 있으며, 유럽의약품품질위원회(European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare) 주관 생물학적제제 국제 숙련도 평가 등에서도 참여기관에서 가능하다면 측정불확도의 산출까지 권고하는 추세이다. 측정불확도 산출은 시험 과정에서 발생할 수 있는 오차에 대한 이해도를 높이고, 결과적으로 시험 결과의 신뢰성•정확성을 향상시킬 수 있는 도구로 활용될 수 있다. 하지만 국가출하승인 검정시험 분야에서는 ISO/IEC 17025를 인정받은 일부 시험항목 외에는 측정불확도의 활용이 제한적이며, 이에 대한 사례나 절차가 발표된 바 없다. 이에 이 연구에서는 혈장분획제제 품질관리시험 중 가장 많이 수행되는 B형 간염 사람 면역글로불린 역가시험을 사례로 Ishikawa 다이어그램 기법을 사용하여 불확도 요인을 파악하고, 각 요인별 불확도 추정 및 최종적으로 확장불확도를 산출해보고자 하였다.

표준물질

B형간염표면항원항체가시험에는 B형 간염 사람 면역글로불린 1차 국가표준품(MFDS code 08/026, 95.45 International Unit (IU)/vial)을 표준물질로 사용하였다. WHO에서는 백신 및 혈장분획제제 등 생물학적제제의 품질관리시험에 요구되는 국제표준품을 전 세계 국가규제실험실 및 제조사 등이 참여하는 국제 다기관 공동연구를 통해 확립하고 있다. 그러나 WHO에서 확립하는 국제표준품은 그 수량이 매우 제한적이어서, WHO에서는 각 국가규제실험실에서 국제표준품을 기준으로 한 국가표준품의 확립을 권고하고 있다.⁸⁾ 이에 아시아지역 생물학적제제 표준화 분야 국가규제기관/국가규제실험실인 식품의약품안전처 식품의약품안전평가원에서는 WHO 국제표준품을 기준으로 우리나라에서 사용되는 생물학적제제의 품질관리시험에 요구되는 국가표준품을 확립해 나가고 있다.⁹⁾ 이 연구에서 사용된 B형 간염 사람 면역글로불린 1차 국가표준품은 1차 국제표준품(National Institute for Biological Standards and Control code W1042, 100 IU/vial)을 기준으로 국내 다기관 공동연구를 통해 확립하였다.

검체, 시약 및 기기

검체는 국가출하승인이 완료되어 시중에 유통 중인 특정 제조번호의 B형 간염 사람 면역글로불린 제품을 사용하였으며, Elecsys Anti-HBs Ⅱ 키트(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 및 cobas e411 자동분석기기(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 실험하였다. 표준물질 및 검체 희석과정에서의 불확도 산출에는 KOLAS 인정 교정기관을 통해 교정받은 0.1, 0.2, 1 mL 마이크로피펫(Eppendorf, Hamburg, Germany), 저울(OHAUS, NJ, USA) 및 온도계를 사용하였다.

B형간염표면항원항체가시험법

국내 국가규제실험실 및 제조사에서 공동연구로 시험법을 조화하여 사용하고 있는 ECLIA B형간염표면항원항체가시험법의 원리는 Figure 1과 같다. 면역글로불린 검체 내의 B형 간염 표면항원 항체는 키트에 포함된 시약 중 비오틴 및 루테늄으로 표지된 B형 간염 표면항원과 항원-항체-항원의 샌드위치 복합체를 형성한다. 이 복합체는 비오틴과 스트렙트아비딘이 결합하는 능력을 이용하여 스트렙트아비딘으로 코팅된 미세입자와 결합한다. 이후 전류를 흘려보내 복합체가 결합된 미세입자를 전극에 고정시킨 후 복합체의 루테늄이 반응하여 방출하는 화학발광을 통해 검체 내 항체가를 측정한다.¹⁰⁾ Diluent Universal 2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용하여 국가표준품을 500, 1000, 2000배 희석한 3개 농도의 표준액을 만들고, 검체를 2000, 3000, 4500배 희석한 3개 농도의 검액을 만들어 시험에 사용하였다(Table 1). 표준액 및 검액을 cobas e411 전용 튜브에 400 μL씩 분주하고 자동분석에 사용할 Elecsys Anti-HBs Ⅱ 키트와 함께 기기에 장착한 후 분석을 시작하였다. 표준액 및 검액의 희석 농도별로 2회씩 총 6회 측정한 결과의 평균값을 산출하고 표준품의 표시역가를 반영하여 {(표준품의 표시역가 ÷ 표준액 평균값) × 검액 평균값}의 식을 활용하여 검체의 역가를 산출하였다.

Fig. 1. Antibody to HBsAg assay principle using ECLIA method.

Table 1 Preparation of reference material and sample solution

Reference material or sample		Preparation
		Solution	Volume/pipet	Final volume
Solution of reference material	Dilution 1X	Dilution 1X	1/1 mL	1 mL
	Dilution 10X	Dilution 1X	0.1/0.1 mL	1 mL
		Diluent	0.9/1 mL
	Dilution 100X	Dilution 10X	0.1/0.1 mL	1 mL
		Diluent	0.9/1 mL
	Dilution 500X	Dilution 100X	0.4/1 mL	2 mL
		Diluent	0.8/1 mL
			0.8/1 mL
	Dilution 1000X	Dilution 500X	1/1 mL	2 mL
		Diluent	1/1 mL
	Dilution 2000X	Dilution 1000X	1/1 mL	2 mL
		Diluent	1/1 mL
Solution of sample	Dilution 10X	Dilution 1X	0.1/0.1 mL	1 mL
		Diluent	0.9/1 mL
	Dilution 100X	Dilution 10X	0.1/0.1 mL	1 mL
		Diluent	0.9/1 mL
	Dilution 1000X	Dilution 100X	0.2/0.2 mL	2 mL
		Diluent	0.9/1 mL
			0.9/1 mL
	Dilution 2000X	Dilution 1000X	1/1 mL	2 mL
		Diluent	1/1 mL
	Dilution 3000X	Dilution 2000X	1/1 mL	1.5 mL
		Diluent	0.5/1 mL
	Dilution 4500X	Dilution 3000X	0.6/1 mL	0.9 mL
		Diluent	0.3/1 mL

통계분석

불확도 산출을 포함한 모든 통계분석은 Microsoft Excel 2019 (Microsoft, WA, USA)를 사용하여 수행하였다.

불확도 요인 분석

측정불확도는 측정값의 분산으로 인해 발생하는 불확실성을 고려하며, 품질관리 통계학자인 K. Ishikawa 박사가 개발한 다이어그램을 사용하여 측정불확도의 원인이 되는 다양한 요인을 분석할 수 있다. Ishikawa 다이어그램은 최종 결과에 기여하는 원인을 찾거나 인과관계를 체계적으로 살펴볼 수 있는 분석 도구이다.^11,12) B형간염표면항원항체가시험에서 측정량은 B형 간염 사람 면역글로불린의 역가이다. 이에 역가시험에 영향을 미칠 수 있는 불확도 요인들을 Figure 2와 같이 Ishikawa 다이어그램 기법을 사용하여 분석하고 각 요인들에 영향을 주는 인자들을 도출하였다. 주요 불확도 요인으로는 표준액의 희석 과정, 검액의 희석 과정, 표준물질을 사용한 검량선 측정 및 검액의 측정 네 개 요인이 최종 선정되었다. 불확도 요인 중 표준액 및 검액의 희석 과정에 영향을 미치는 인자로는 희석에 사용하는 마이크로피펫, 온도 및 반복측정이 포함되었으며, 표준물질을 사용한 검량선 및 검액의 측정에 영향을 미치는 인자로는 반복측정이 포함되었다. Table 2는 이 연구에서 도출된 불확도 요인들의 특성을 나타낸다. 불확도 산출시 반복성과 관련된 요인은 A형 불확도로 계산하고, 교정성적서 등에 해당하는 요인은 B형 불확도로 계산하며,¹³⁾ 이에 따라 표준액 및 검액의 희석 과정에는 A형 및 B형 불확도가 포함되며, 표준물질을 사용한 검량선 및 검액의 측정에는 A형 불확도가 포함되는 것으로 나타났다.

Fig. 2. Ishikawa diagram demonstrating the individual impacts to the measurement uncertainty for the antibody to HBsAg assay.

Table 2 Major uncertainty factors influencing the antibody to HBsAg assay

Major factors for the measurement uncertainty	Types	Variables
Dilution process for reference materials (Instrument, temperature, and repeatability)	A+B	uDRM
Dilution process for samples (Instrument, temperature, and repeatability)	A+B	uDS
Calibration curve measurement using reference materials (Repeatability)	A	uCC
Sample measurement (Repeatability)	A	uSM

불확도 요인별 불확도 산출

표준액 및 검액의 희석 과정에서 용액의 부피에 따른 불확도 요인으로 마이크로피펫의 교정성적서의 불확도, 온도 편차에 따른 불확도 및 반복측정에 따른 불확도를 고려하였다. 마이크로피펫의 표준불확도는 0.1, 0.2, 1 mL 마이크로피펫의 교정성적서에 따른 교정불확도(0.1 mL: ± 0.00007 mL, 0.2 mL: ± 0.00017 mL, 1 mL: ± 0.0007 mL)를 포함인자(k = 2)로 나누어 산출하였다. 자유도는 ∞로 산출되었다. 온도 편차에 따른 표준불확도는 {각 측정 용량(mL) × (실험 수행온도(24 ℃) - 교정 수행온도(20 ℃) × 물의 부피팽창계수(0.00021 K^-1)¹⁴⁾ ÷ 3}의 식을 통해 산출하였다. 자유도는 ∞로 산출되었다. 반복측정에 따른 표준불확도는 각 측정 용량별로 마이크로피펫을 사용하여 증류수를 10회 반복측정한 무게(g)를 20 ℃에서의 물의 비중(0.99823 g/mL)으로 나누어 부피(mL)를 계산하고, 이 부피 값들의 표준편차를 10으로 나누어 산출하였다. 반복측정의 자유도는 (반복측정 횟수-1)로 9로 산출되었다. Table 3에서 0.1/0.1 mL는 0.1 mL 마이크로피펫을 사용하여 0.1 mL를 취할 때의 불확도를, 0.2/0.2 mL는 0.2 mL 마이크로피펫을 사용하여 0.2 mL를 취할 때의 불확도를, 0.3/1, 0.4/1, 0.5/1, 0.6/1, 0.8/1, 0.9/1, 1/1 mL는 1 mL 마이크로피펫을 사용하여 각 부피를 취할 때의 불확도를 산출한 결과를 나타낸다.

Table 3 Uncertainty calculated from each uncertainty factors

Uncertainty factors			Combined standard uncertainty	Relative standard uncertainty		Degree of freedom
Dilution process for reference materials	Dilution 1X	1/1 mL	0.00068	0.00068		167
	Dilution 10X	0.1/0.1 mL	0.00014	0.00140	0.0016	23
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
	Dilution 100X	0.1/0.1 mL	0.00014	0.00140	0.0016	23
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
	Dilution 500X	0.4/1 mL	0.00051	0.00128	0.0017	156
		0.8/1 mL	0.00064	0.00080
		0.8/1 mL	0.00064	0.00080
	Dilution 1000X	1/1 mL	0.00068	0.00068	0.0010	333
		1/1 mL	0.00068	0.00068
	Dilution 2000X	1/1 mL	0.00068	0.00068	0.0010	333
		1/1 mL	0.00068	0.00068
	Combined		-	0.0032		165
Dilution process for samples	Dilution 10X	0.1/0.1 mL	0.00014	0.00140	0.0016	23
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
	Dilution 100X	0.1/0.1 mL	0.00014	0.00140	0.0016	23
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
	Dilution 1000X	0.2/0.2 mL	0.00020	0.00099	0.0015	104
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
		0.9/1 mL	0.00071	0.00079
	Dilution 2000X	1/1 mL	0.00068	0.00068	0.0010	333
		1/1 mL	0.00068	0.00068
	Dilution 3000X	1/1 mL	0.00068	0.00068	0.0015	39
		0.5/1 mL	0.00068	0.00135
	Dilution 4500X	0.6/1 mL	0.00056	0.00093	0.0019	74
		0.3/1 mL	0.00051	0.00169
	Combined		-	0.0038		223
Calibration curve measurement using reference materials			1.091	0.0088		4
Sample measurement			2.187	0.0062		35

표준물질을 사용한 검량선 및 검액의 측정에 따른 불확도 요인으로는 반복측정에 따른 불확도가 고려되었다. 검량선의 비직선성은 측정결과의 주요한 불확도 요인이 될 수 있으며, 이에 검량선 측정에 사용되는 3개 농도인 500, 1000, 2000배 희석 표준액을 각 2회 반복측정한 결과의 평균값을 이용하여 선형 최소 제곱법으로 계산하였다. 표준불확도는 아래 식에 따라 산출하였으며,^15,16) 상대표준불확도는 표준불확도를 희석배수를 고려하지 않은 검액의 평균값인 123.4 IU/L로 나누어 산출하였고 0.0088로 나타났다. 자유도는 (전체 측정 횟수-2)로 4로 산출되었다.

검액의 반복측정에 따른 표준불확도는 2000, 3000, 4500배 희석한 3개 농도의 검액을 총 36회 반복측정한 결과의 표준편차인 13.125를 반복측정 횟수의 제곱근으로 나누어 2.18761로 산출되었으며, 자유도는 (반복측정 횟수-1)로 35로 산출되었다. 상대표준불확도는 표준불확도를 희석배수를 고려한 검액의 평균값인 350.8 IU/mL로 나누어 산출하였고, 0.0062로 나타났다.

불확도 요인별 산출된 상대표준불확도 및 자유도는 Table 3과 같으며, 자유도는 Welch-Satterthwaite 공식을 이용하여 산출하였다.¹⁴⁾

확장불확도 산출

이 연구에서 선정된 네 개의 주요 불확도 요인들을 하나로 합성하는 합성표준불확도(u_c)는 아래 식에 따라 산출하였으며, 주요 불확도 요인별 상대표준불확도를 통해 산출된 상대합성표준불확도(u_r)에 측정된 B형 간염 사람 면역글로불린의 역가를 대입하여 산출하였다.

유효자유도(v_eff)는 주요 불확도 요인들에 대한 자유도를 합성하여 아래 식에 따라 산출하였으며, 불확도 요인별 상대표준불확도의 네 제곱 값을 각 자유도로 나눈 값을 모두 합산한 후, 상대합성표준불확도(u_r)의 네 제곱 값을 앞에서 산출된 값으로 나누어 산출하였다.

포함인자(k)는 신뢰수준 약 95 %에서 유효자유도가 10 이상이면 k = 2, 유효자유도가 9 이하이면 t-분포표에서 포함인자를 찾아 적용한다.¹⁴⁾ 이에 따라 이 연구에서 산출된 유효자유도는 13이므로, k = 2를 포함인자로 결정하였다. KOLAS-G-001 지침에서는 확장불확도를 측정량의 합리적인 추정값이 이루는 분포의 대부분을 포함할 것으로 기대되는 측정결과 주위의 어떤 구간을 정의하는 양으로 정의하고 있다. 앞에서 산출된 합성표준불확도, 유효자유도 및 포함인자를 통해 B형간염표면항원항체가시험에 대한 확장불확도(U)를 합성표준불확도(3.0002 IU/mL)에 포함인자(k = 2)를 곱하여 6 IU/mL로 산출하였으며, 이 연구에서 검체로 사용된 정맥주사용 B형 간염 사람 면역글로불린 제품의 역가에 대해 다음과 같이 확장불확도를 표현하고자 하였다.

불확도 요인별 기여량 산출

각 불확도 요인들이 합성표준불확도에 얼마만큼 기여하고 있는지를 수치적으로 표현하는 불확도 기여량은 전체 기여량의 합을 100 %로 고려하여 불확도 요인별 상대표준불확도의 제곱 값을 상대합성표준불확도의 제곱 값으로 나누어 계산하였다.¹⁷⁾ B형 간염 사람 면역글로불린의 역가시험에 있어 네 개 주요 불확도 요인별 기여량 산출 결과는 Table 4와 같다. 불확도 요인별 기여량을 살펴보면 표준물질을 사용한 검량선 측정, 검액의 측정, 검액의 희석 과정 및 표준액의 희석 과정 순으로 불확도가 높게 나타났으며, 특히 표준물질을 사용한 검량선 측정의 기여량이 55.15 %, 검액의 측정이 27.44 %로 다른 두 요인에 비해 높게 나타났다.

Table 4 Contribution of each uncertainty factors

Uncertainty factors	Relative standard uncertainty	Degree of freedom	Uncertainty contribution (%)
Calibration curve measurement using reference materials	0.0088	4	55.15
Sample measurement	0.0062	35	27.44
Dilution process for samples	0.0038	223	10.19
Dilution process for reference materials	0.0032	165	7.22
Combined relative standard uncertainty	0.0119	13	100.00

이 연구는 혈장분획제제 중 B형 간염 사람 면역글로불린을 포함한 면역글로불린제제의 역가시험에 사용되는 B형간염표면항원항체가시험의 불확도 요인을 탐색하고, 이를 통해 생물학적제제의 품질관리시험으로는 최초로 측정불확도 산출 사례를 제시하기 위한 목적으로 수행되었다. B형간염표면항원항체가시험에 영향을 미치는 불확도 요인은 Ishikawa 다이어그램을 작성하여 파악하였으며, 표준액의 희석 과정, 검액의 희석 과정, 표준물질을 사용한 검량선 측정 및 검액의 측정을 주요 요인으로 선정하였다. ｢생물학적제제 기준 및 시험방법｣에 따른 B형 간염 사람 면역글로불린제제의 B형간염표면항원항체가시험 기준은 200 IU/mL 이상이며, 이 연구에서 검체로 사용한 제품의 측정값은 252 IU/mL로, 산출된 확장불확도 6 IU/mL를 고려했을 때도 기준을 충분히 만족하는 결과를 나타내었다. KOLAS-G-005 해설서에 따르면 측정불확도 평가시 각 시험에 대한 불확도의 모든 주요 요인에 대한 파악이 요구되며, 전체 불확도 크기의 1/3~1/5 이하의 불확도 요인은 일반적으로 전체 불확도에 큰 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 이 연구를 통해 B형 간염 사람 면역글로불린의 역가시험 수행시 검량선 측정의 직선성을 높임으로써 실험 과정에서 발생할 수 있는 오차를 최소화할 수 있음을 알 수 있었으며, 생물의약품 표준품의 특성상 실제 시험에 적용되는 표시역가(assigned potency)의 안정적인 유지 여부 확인을 위한 안정성 평가가 매우 중요할 것으로 판단된다.¹⁹⁾ 또한 표준물질 및 검액의 각 희석농도별로 2회 반복측정한 결과의 평균값을 사용하는 현재의 시험 절차가 표준물질 및 검액의 측정에 따른 불확도를 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다. 백신 및 혈장분획제제 등 생물학적제제와 관련된 품질관리시험에서는 표준물질 또는 표준품을 사용하여 검량선을 작성하고, 여기에 검체의 측정값을 대입하거나, 직선성을 나타내는 표준물질과 검체의 용량-반응 관계를 상대적으로 비교하는 평행선 모델(parallel-line model)과 같은 방법이 주로 사용되고 있다.²⁰⁾ 이에 이 연구 결과는 B형간염표면항원항체가시험에 대한 단편적인 사례 연구로써 불확도 요인 및 측정불확도 산출을 제시하였으나, 향후 다양한 생물학적 시험의 품질을 개선하는데 활용될 수 있을 것으로 기대하며, 이와 같은 노력을 통해 식품의약품안전처의 생물학적제제 국가출하승인 검정시험의 신뢰성 향상에도 기여할 수 있을 것이라고 판단된다.

이 연구는 식품의약품안전처 예산으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

모든 저자는 이해상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Chan Woong Choi : Scientific officer, DVM, PhD

Hyung Sil Moon : Scientific officer

Yun Su Bang : Researcher

Seong Suk Son : Researcher

Young Hoon Kim : Director