혈장분획제제(plasma-derived medicinal products)는 사람 혈장 중 미량 존재하는 혈장단백성분을 대량의 혈장으로부터 추출하여 농축시킨 의약품으로, 알부민, 면역글로불린 및 응고인자 등이 있다. 혈장분획제제는 수백명에서 수천명의 헌혈자로부터 혈장을 수집하여 하나의 제품단위로 제조되기 때문에 바이러스 등에 감염된 혈장이 일부만 포함되어도 제품 전체가 오염되므로 원료 단계부터 제조공정 관리에 역점을 두고 있다.¹⁾ 또한 우리나라를 포함한 많은 국가규제기관에서는 혈장분획제제 완제의약품을 시판하기 전에 제조사가 허가사항에 따라 제조·시험하였는지 자료를 검토하고, 검정시험을 통해 제조단위별 품질을 직접 확인하여 종합적인 평가결과가 적합한 안전성·유효성이 확보된 의약품만이 출하되도록 국가출하승인(national lot release) 제도를 운영하고 있다.^2,3) 혈장분획제제 중 면역글로불린은 개별혈장을 풀링(pooling)하여 냉에탄올 분획(cold ethanol fractionation) 및 바이러스 불활화 공정 등을 거쳐 얻은 감마글로불린의 농축용액으로 선천성 저감마글로불린혈증, 무감마글로불린혈증, 바이러스성 질환의 증상 경감 및 길랑바레증후군 등의 치료에 사용된다.^1,4) 또한 면역글로불린 중 B형 간염 사람 면역글로불린은 혈장분획제제 제조 목적으로 B형 간염 백신 등을 접종해 면역된 특수혈장을 사용하여 제조되며, 성인 및 신생아의 B형 간염 치료 및 예방 목적 등으로 사용된다.⁵⁾

B형간염표면항원항체가시험(antibody to hepatitis B surface antigen assay)은 B형 간염 감염 여부를 판단하거나 예방접종 후, 수술 전 또는 건강검진 목적으로 많이 수행되는 검사항목 중 하나였다.⁶⁾ 또한 이 시험은 위와 같은 목적 외에도 유럽연합 및 일본 등의 공정서에 면역글로불린제제의 효능을 평가하는 역가시험으로 수재되어 있다.^7,8) 2000년대 초 국내·외 규정 및 제조사 시험에서 면역글로불린제제의 역가시험을 홍역항체가시험에서 B형간염표면항원항체가시험으로 대체하였다. 홍역항체가시험은 바이러스 및 동물 세포주를 이용하기 때문에 시험에 필요한 원료를 지속적으로 유지·관리하는데 어려움이 있으며, 홍역항체가를 면역글로불린제제의 역가로 대표한다는 난점이 대체 사유였다.⁹⁾ B형간염표면항원항체가시험은 초기 방사성면역분석법(radioimmunoassay)과 수동혈구응집법(passive hemagglutination assay)이 개발되었고, 이후 진보된 검사법인 효소면역측정법(enzyme immunoassay)과 미세입자고착효소면역검사법(microparticle enzyme immunoassay)의 도입으로 보다 정확한 정량이 가능하게 되었다. 현재는 효소결합면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 및 화학발광면역검사법(chemiluminescence assay)이 보편화되어 사용되고 있다.^{10,11,12,13,14)}

이 연구에서는 시험과정이 비교적 간편하고 전세계적으로 많이 사용되고 있는 ELISA 시험법을 지속 활용하고, 판매가 중단된 기존 ELISA 키트를 대체할 새로운 키트를 확보하고자 후보 키트에 대해 적합성을 평가하였다. 또한 ELISA 보다 정밀성이 뛰어난 자동분석기기를 이용한 전기화학발광면역분석법(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)의 적합성을 평가하고, 후보 키트들 간의 상관성을 분석하여 새롭게 국가출하승인 검정시험에 사용할 B형간염표면항원항체가시험법을 확립하고자 한다. 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 및 전세계 국가규제기관에서는 시험방법 밸리데이션 수행을 통한 유효성이 확인된 표준화된 시험법을 사용한 생물학적제제 품질관리의 중요성을 강조하고 있다.^15,16) 이에 국가규제실험실인 식품의약품안전평가원 및 국내 혈장분획제제 제조사가 참여한 다기관 공동연구를 통해 시험법을 상호 검증하였다. 또한 이 공동연구 결과를 토대로 표준화된 B형간염표면항원항체가시험법을 확립하여 국제 기준과 조화된 국가출하승인 검정시험 수행을 위한 기반을 마련하고자 하였다.

표준품 및 검체

B형 간염 사람 면역글로불린 1차 국가표준품(national standard)(Ministry of Food and Drug Safety code 08/026, 95.45 International Unit (IU)/vial)을 표준품으로 사용하였으며, 이 국가표준품을 특정 농도로 제작하여 검체로도 사용하였다. 시험법을 적용한 국내 허가제품 분석에 사용된 검체는 국내 허가•유통 중인 면역글로불린제제로 Sample 1은 근육주사용 B형 간염 사람 면역글로불린, Sample 2, 3은 정맥주사용 B형 간염 사람 면역글로불린, Sample 4, 5, 6은 정맥주사용 사람 면역글로불린, Sample 7은 근육주사용 사람 면역글로불린 제품을 사용하여 분석하였다.

ELISA 키트, 기기 및 시험방법

ELISA 후보 키트로는 키트 A(Monolisa™ Anti-HBs PLUS, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France) 및 키트 B(WANTAI anti-HBs ELISA, Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterpris, Beijing, China) 2종을 선정하였다. ELISA 시험에는 의료용 효소분석기(SpectraMax 190 및 SpectraMax ABS Plus, Molecular Devices, San Jose, USA)와 마이크로 플레이트 세척기(405 LS, BioTek, Santa Clara, USA)를 사용하였으며, 모두 설치 및 운전 적격성 평가를 완료한 후에 시험에 사용되었다.

키트 A의 시험방법은 다음과 같다. 마이크로 플레이트에 희석액 25 μL와 측정할 물질을 75 μL 넣고 37 ℃에서 60분간 반응시킨다. 이 후 마이크로 플레이트 세척기를 이용해 세척완충액 400 μL로 5회 씻어낸 후 접합용액(conjugate working solution) 100 μL를 넣고 37 ℃에서 60분간 반응시킨다. 반응시킨 용액을 동일한 방법으로 세척한 후 기질 희석용액(working diluted substrate solution) 100 μL를 넣고 18–25 ℃에서 30분간 반응시킨다. 정지용액(stop solution) 100 μL로 반응을 중단시키고 파장 450 nm에서 흡광도를 측정한다.

키트 B의 시험방법은 다음과 같다. 마이크로 플레이트에 측정할 물질 50 μL와 과산화효소용액(horseradish peroxidase) 50 μL를 넣고 37 ℃에서 60분간 반응시킨다. 이 후 마이크로 플레이트 세척기를 이용해 세척완충액 400 μL로 5회 씻어낸 후 색소원(chromogen) A 50 μL 및 색소원 B 50 μL를 넣고 37 ℃에서 15분간 반응시킨다. 정지용액 50 μL로 반응을 중단시키고 파장 450 nm에서 흡광도를 측정한다.

ECLIA 키트, 기기 및 시험방법

ECLIA 후보 키트로는 키트 C(Elecsys Anti-HBs Ⅱ kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 선정하였다. ECLIA 시험에는 자동분석기기(cobas e411 및 cobas e601, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하였으며, 설치 및 운전 적격성 평가를 완료한 후에 시험에 사용되었다. 키트 C의 시험방법은 다음과 같다. 측정할 물질을 샘플튜브에 400 μL씩 담아 기기에 장착한다. 자동분석에 사용할 Elecsys Anti-HBs Ⅱ 키트 및 기타 소모품을 기기에 장착하고 검체 정보를 입력한 후 분석을 시작한다.

시험방법 밸리데이션 및 국내 허가제품 분석

완제의약품을 주성분(면역글로불린)이 검출되지 않도록 희석 후, 안정화제(말토오스수화물)를 허가사항과 동일한 농도(100 mg/mL)로 첨가한 용액을 기질(matrix)로 조제하였다. 이 기질에 국가표준품을 첨가(spiking)하여 ELISA 키트의 표준곡선 측정 범위(10–150 IU/L)를 고려하여 선정된 농도 20, 60, 100, 140 IU/L로 검체를 조제하여 특이성, 직선성, 범위, 실험실 내 정확성 및 정밀성, 실험실 간 정밀성 항목을 확인하였다. 시험방법 밸리데이션 판정기준은 Table 1과 같다.^17,18) 실험실 내 정확성 및 정밀성은 각 농도의 검체에 대해 2명의 시험자가 6회/일, 3일 간 반복 측정하여 결과를 분석하였으며, 이 중 완건성은 ELISA 및 ECLIA 시험에 사용되는 기기의 종류를 달리하여 결과를 분석하였다. 실험실 간 정밀성은 식품의약품안전평가원 및 혈장분획제제 제조사 3개 실험실의 결과를 비교·분석하였다. 밸리데이션이 완료된 시험법을 적용하여 국내 면역글로불린 제품을 분석하고, 실험실 간 편차를 확인하였다.

Table 1 The acceptance criteria of analytical method validation

Analytical performance characteristics	Acceptance criteria
Specificity	No matrix interference
Linearity	R2 ≥ 0.99
Range	Acceptable degree of linearity, accuracy, and precision
Accuracy	80 % ≤ Recovery ≤ 120 %
Precision	RSD ≤ 10 %

통계분석

모든 통계분석은 Microsoft Excel 2019 (Microsoft, WA, USA)를 사용하여 수행하였으며, 그룹 간의 유의성 검증은 유의수준 5 % 하에서 양측 검정을 원칙으로 하였다. 실험 중에 발생한 오류와 같이 명백한 이상치는 분석에서 제외하고 결측치는 보정 없이 분석되었다. 세부적으로 역가의 평균, 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(relative standard deviation, RSD) 등을 요인 수준에 따라 제시하였다. Fig. 2 box and whiskers plot은 Prism v8.4.3 software (GraphPad Software, CA, USA)를 사용하여 작성하였다.

Fig. 2. The reproducibility results of analytical method validation for ELISA and ECLIA kits.
(a) ELISA Kit A (b) ELISA Kit B (c) ECLIA Kit C. The box extends from the 25th to the 75th percentiles, while the central line indicates the median. The whiskers extend to the smallest and largest values.

시험방법 밸리데이션

특이성, 직선성 및 범위: ELISA 키트 A, B의 특이성 검증을 위해 기질만을 측정하였을 때 키트 구성품인 음성대조군의 흡광도 적합범위(0.000–0.070)에 포함되는 것으로 나타났으며, 기질과 20 IU/L 농도 검체의 평균 흡광도를 t-test로 비교했을 때, 키트 A는 기질 0.064, 20 IU/L 농도 검체 0.172, 키트 B는 기질 0.005, 20 IU/L 농도 검체 0.232로 유의적인 차이가 나타났다. 또한 검체 측정 결과가 모든 농도(20, 60, 100, 140 IU/L)에서 회수율이 적합범위(80-120 %) 이내였으므로 이는 기질이 B형간염표면항원항체가 측정에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. ECLIA 키트 C의 특이성 결과에서도 기질 또는 검체희석액을 측정한 값이 음성대조군의 적합범위(5 IU/L 이하) 내에 분포하였고, 검체를 특정농도(20, 60, 100, 140 IU/L)로 희석하여 측정한 결과에서도 회수율을 만족하였다. 따라서 두 시험법 모두 주성분을 제외한 기질 등이 역가 측정에 영향을 주지 않고 특이적으로 면역글로불린의 역가 측정이 가능한 시험법임을 확인하였다. 직선성을 확인하기 위해 목표농도를 20, 60, 100, 140 IU/L로 제작한 검체를 측정하여 얻은 실제 측정값과 비교했을 세 키트의 직선성(R²)이 각각 1.00, 0.99, 0.99로 모두 0.99 이상으로 나타났으며(Fig. 1), 이에 따라 범위는 직선성 및 정밀성의 기준을 만족하는 20–140 IU/L로 결정하였다.

Fig. 1. The linearity results of analytical method validation for ELISA and ECLIA kits.
(a) ELISA Kit A (b) ELISA Kit B (c) ECLIA Kit C.

실험실 내 정확성 및 정밀성: 정확성은 실험실 내 정밀성 결과와 연계하여 산출하였으며, 세 키트 모두 모든 농도에서 회수율 기준인 80–120 %를 만족하였다(Table 2). 실험실 내 정밀성에는 시험 수행에 관련될 수 있는 서로 다른 시험자, 시험일, 기기 및 환경조건 등이 포함될 수 있다. 시험자 및 시험일 간 정밀성을 분석한 결과, 키트 A 1.18–3.23, 1.94–2.43 %, 키트 B 3.23–6.50, 4.82–8.06 %, 키트 C 0.98–5.12, 2.13–6.49 %로 모두 RSD 10 % 이하로 나타났으나, 키트 B의 RSD가 다른 두 키트에 비해 높은 것으로 나타났다(Table 2).

Table 2 The validation results of precision and accuracy

Kit	Validation parameter			Sample concentration
				20 IU/L	60 IU/L	100 IU/L	140 IU/L
Kit A	Intra-laboratory	Day	Mean (IU/L)	19.59	60.59	100.91	140.14
			RSD (%)	3.23	1.18	1.41	1.22
			Recovery (%)	97.96	100.99	100.91	100.10
		Analyst	Mean (IU/L)	19.66	60.02	100.42	138.32
			RSD (%)	1.94	2.38	2.11	2.43
			Recovery (%)	98.28	100.03	100.42	98.80
		Instrument	Mean (IU/L)	20.75	60.24	99.81	141.03
			RSD (%)	5.24	2.28	1.81	0.98
			Recovery (%)	103.75	100.40	99.81	100.74
	Inter-laboratory		Mean (IU/L)	20.22	58.82	97.20	137.50
			RSD (%)	5.52	4.76	6.36	3.72
			Recovery (%)	101.12	98.03	97.20	98.21
Kit B	Intra-laboratory	Day	Mean (IU/L)	24.04	71.60	115.64	152.81
			RSD (%)	6.50	6.02	4.96	3.23
			Recovery (%)	120.18	119.34	115.64	109.15
		Analyst	Mean (IU/L)	22.92	66.09	108.90	146.19
			RSD (%)	8.06	6.25	4.89	4.82
			Recovery (%)	114.60	110.15	108.90	104.42
		Instrument	Mean (IU/L)	23.35	66.91	114.52	154.41
			RSD (%)	4.42	6.18	3.77	4.60
			Recovery (%)	116.75	111.52	114.52	110.29
	Inter-laboratory		Mean (IU/L)	21.56	63.95	103.05	141.47
			RSD (%)	9.01	9.86	9.41	8.68
			Recovery (%)	107.81	106.58	103.05	101.05
Kit C	Intra-laboratory	Day	Mean (IU/L)	21.06	61.99	99.96	141.01
			RSD (%)	3.20	2.12	0.98	5.12
			Recovery (%)	105.30	103.32	99.96	100.72
		Analyst	Mean (IU/L)	21.90	63.02	101.23	141.62
			RSD (%)	6.49	2.84	2.13	4.37
			Recovery (%)	109.51	105.03	101.23	101.16
		Instrument	Mean (IU/L)	22.60	60.94	98.16	134.00
			RSD (%)	4.36	1.19	1.17	0.81
			Recovery (%)	113.00	101.57	98.16	95.71
	Inter-laboratory		Mean (IU/L)	22.00	62.53	100.52	138.83
			RSD (%)	5.01	3.19	2.64	3.99
			Recovery (%)	109.99	104.21	100.52	99.16

정밀성 중 완건성은 서로 다른 기기(ELISA 의료용 효소분석기 및 ECLIA 자동분석기기)를 사용하였을 때 시험에 미치는 영향을 확인하였으며, 키트 A 0.98–5.24 %, 키트 B 3.77–6.18 %, 키트 C 0.81–4.36 %로 모두 RSD 10 % 이하로 나타났다(Table 2). 이 연구에서는 상용 키트를 사용한 시험방법의 밸리데이션으로 기기 간 비교를 통해 완건성을 평가하였으나, 향후 국제의약품규제조화위원회(International Council of Harmonization) 가이드라인 Q2 (R1) Analytical Validation 및 Q14 Analytical Procedure Development에 따라 완건성이 충분히 확보된 생물학적제제 시험법의 개발 및 위험관리 방법인 분석 설계기반 품질고도화 기법(Analytical Quality by Design)을 활용하여 의약품 제조 분야의 글로벌 경쟁력을 확보하기 위한 선제적 연구가 필요하다고 판단된다.^18,19)

실험실 간 정밀성: 『생물학적제제 기준 및 시험방법』 제제 각조에 세부적인 시험법이 아닌 시험원리가 수재되어 있는 경우 검정시험을 위한 시험법 도입에는 시험방법 밸리데이션 항목 중 여러 시험실이 참여한 실험실 간 정밀성(재현성)의 확인이 필수적이다.^9,16) 이에 3개 실험실 간 정밀성을 확인하기 위해3일간 시험한 결과, 키트 A 3.72–6.36 %, 키트 B 8.68–9.86 %, 키트 C 2.64–5.01 %로 모두 RSD 10 % 이하로 나타났다(Table 2). 다만, 키트 B의 경우 RSD가 다른 두 키트에 비해 높은 것으로 나타났으며, 실험실 A의 측정 결과가 다른 두 실험실에 비해 높게 나타나는 경향을 나타냈다(Fig. 2). 참고로 제조사에서는 ELISA 시험에 의료용 효소분석기(SpectraMax M2e, Molecular Device, San Jose, USA 및 Infinite M200pro, Tecan, Männedorf, Switzerland)를, ECLIA 시험에cobas e601 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하였다.

시험방법 밸리데이션 결과, ELISA 및 ECLIA 시험법 모두 밸리데이션 항목의 기준에 적합한 것으로 나타났으나, 키트 B의 경우 항목 전반에 걸쳐 키트 A, C에 비해 편차가 높게 나타났기 때문에 해당 키트의 사용에는 시험자의 숙련도에 대한 고려가 필요하다고 판단된다. 2022년 ECLIA를 사용하는 실험실을 추가하여 총 3개 실험실이 참여한B형 간염 사람 면역글로불린 2차 국가표준품 확립 공동연구 결과에서도 ELISA가 ECLIA 시험법에 비해 높은 편차를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.²⁰⁾ 이러한 연구결과를 바탕으로 현재 국내 국가규제실험실 및 제조사에서는 B형간염표면항원항체가시험을 ECLIA 시험법으로 조화하여 국내 면역글로불린제제의 품질관리 일관성 및 신뢰성을 제고하고자 하였다.

면역글로불린 제품의 역가 모니터링

이 연구를 통해 밸리데이션이 완료된 B형간염표면항원항체가시험법을 적용하여 면역글로불린 제품별 역가를 측정하였다. 국가출하승인 및 제조사 품질관리에 있어 실질적으로 완제의약품을 시험하는 실험실별 분석 수준 및 실험실 간 편차를 분석하였다. 분석 결과, 키트 A, C는 7개 제품 모두 3개 실험실에서 RSD 10 % 이하로 나타났다. 이에 반해 키트 B는 7개 제품 중 3개 제품에서 RSD 10 %를 초과하는 것으로 나타났으며, 시험방법 밸리데이션 과정에서 나타났던 것과 같이 완제의약품 역가 측정 시에도 높은 편차를 나타내었다(Table 3). 이와 같은 결과는 키트 B를 사용한 시험방법 밸리데이션 결과를 비롯하여 기존의 연구에서 지적한 동일 검체의 상용 키트간 역가 차이 와도 유사한 것으로 판단된다.²¹⁾ 그러나 정확한 원인분석을 위해서는 상대적으로 수동 시험법인 ELISA 시험법이 시험자 숙련도에 민감한 점, 다량의 분석을 비교적 짧은 시간에 수행한 결과라는 점, 그리고 큰 희석배수로 희석한 완제의약품 검액의 실시간 안정성 등에 따른 영향을 고려하여 추후 추가적인 검토가 필요한 것으로 판단된다.

Table 3 Potency assay results of human immunoglobulin preparations approved in Korea

Samples		Kit			National lot release results
		Kit A	Kit B	Kit C
Sample 1	Mean (IU/mL)	274	301	259	274
	RSD (%)	1.7	5.8	2.1
Sample 2	Mean (IU/mL)	216	221	237	255
	RSD (%)	7.8	7.9	2.9
Sample 3	Mean (IU/mL)	221	208	212	288
	RSD (%)	6.1	7.3	2.2
Sample 4	Mean (IU/50 mg)	2.99	3.90	2.70	2.74
	RSD (%)	2.9	12.1	6.4
Sample 5	Mean (IU/50 mg)	3.10	3.38	2.75	3.38
	RSD (%)	4.7	2.8	6.0
Sample 6	Mean (IU/50 mg)	1.52	2.10	1.24	1.12
	RSD (%)	4.5	20.6	5.5
Sample 7	Mean (IU/50 mg)	1.22	1.29	0.85	0.99
	RSD (%)	8.0	31.9	3.3

국가출하승인 검정시험 중 면역글로불린제제 역가시험의 연속성 유지를 위해 신규 ELISA 및 ECLIA 키트를 사용하여 다기관 공동연구를 통해 시험방법 표준화 및 밸리데이션을 수행하였다. ELISA 후보 키트 A, B 및 ECLIA 후보 키트 C 모두 실험실 내 정밀성을 포함한 시험방법 밸리데이션 항목의 기준을 만족하였으며, 실험실 간 정밀성 확인을 위한 다기관 공동연구 결과에서도 세 키트 모두 RSD 10 % 이하로 기준을 만족하였다. 그러나 ELISA 키트 B의 경우 밸리데이션 항목 전반에 걸쳐 결과의 편차가 키트 A, C에 비해 높게 나오는 경향을 나타내었다. 자동분석기기를 이용한 ECLIA는 ELISA에 비해 시험자의 숙련도에 따른 편차가 적을 뿐만 아니라 신속하고 동시처리 가능한 검체 수가 많은 장점이 있으며, 국내 면역글로불린제제의 생산량 증가에 따라 국가출하승인 검정시험을 비롯하여 제조사 자체적으로도 품질관리시험의 활용 범위가 더욱 커질 것으로 기대되는 방법이다. ELISA 시험법은 비교적 방법이 간단하고 전세계적으로 현재까지도 많이 사용되는 방법으로 국가출하승인 검정시험 및 제조사의 품질관리시험에 있어 예비 시험법으로 활용 가능성이 있어, 이 연구를 통해 두 시험법의 상호 활용 가능성에 대해 충분한 근거를 마련하였다고 판단된다. 또한 국내 면역글로불린제제의 역가 모니터링을 통해 완제의약품 품질관리에 ELISA 및 ECLIA 시험법을 즉시 적용 가능한 것을 확인하였다. 이 연구를 통해 국가출하승인 검정시험법의 도입, 확립 과정 및 시험방법 밸리데이션 절차에 대한 규제과학적 정보를 공유하고, 현재 혈장분획제제 자급화 추진을 위해 노력하고 있는 아시아지역 중저소득국가의 국가규제실험실에 B형간염표면항원항체가시험에 대한 기술 전수를 통해 아시아 지역을 포함한 전세계적으로 표준화된 시험법으로 인정·확산하는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.²²⁾

본 연구는 식품의약품안전처(과제번호 21111생물안188) 연구개발비로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

모든 저자는 이해상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Su Kyoung Seong : Senior scientific officer

Hyun Jeong Kim : Researcher

Yun Su Bang : Researcher

Kyung Hee Sohn : Director, Ph.D.

Young Hoon Kim : Director

Kiwon Han : Assistant Professor, DVM, Ph.D.

Chan Woong Choi : Scientific officer, DVM, Ph.D.