사람 혈장 유래 의약품인 정맥주사용 면역글로불린제제는 보관을 포함한 제조공정 중 온도 및 pH 변화에 따라 중합물이 생성될 수 있으며, 이렇게 생성된 중합물은 체내 보체를 활성화시켜 발진, 두통, 발열, 구토, 빈맥과 같은 부작용을 유발할 수 있다.^1,2) 이에 우리나라를 포함한 국가규제기관에서는 면역글로불린제제의 품질관리 시험에 중합물부정시험(Molecular size distribution) 및 항보체성부정시험(Anti-complementary activity)을 수행하고 있으며, 기준 설정을 통해 안전한 혈장분획제제가 사용될 수 있도록 관리하고 있다.³⁾ 중합물부정시험은 완제의약품에 존재할 수 있는 중합물 및 응집체의 함량을 측정하는 시험이며, 항보체성부정시험은 생성된 중합물로 인한 보체 소모량을 측정하는 안전성 시험이다.^4,5) 현재까지 발표된 국내·외 연구에서는 각 시험에 요구되는 시험법을 표준화하고, 표준물질을 확립하였지만, 면역글로불린제제에서 생성될 수 있는 중합물 및 보체 소모량 간의 상관성을 직접적으로 확인해보지는 않았다. 이에 본 연구에서는 면역글로불린제제의 제조공정 중 중요한 보관조건인 온도 및 pH의 변화에 따른 가혹조건이 제품의 안전·유효성에 미치는 영향을 확인해보고자 한다.

표준품 및 검체

Human immunoglobulin (molecular size) biological reference preparation (BRP) batch 2 (European Directorate for the Quality of Medicines & Healthcare (EDQM), Strasbourg, France) 및 Human immunoglobulin for anti-complementary activity BRP (EDQM, Strasbourg, France)가 각각 중합물부정시험 및 항보체성부정시험의 표준품으로 사용되었다. 검체는 국내 허가·유통 중인 정맥주사용 면역글로불린제제로 Sample 1, Sample 2-1, Sample 2-2, Sample 3-1, Sample 3-2로 명명하였다. Sample 1, Sample 2-1, Sample 2-2는 정맥주사용 정상 면역글로불린이며, Sample 3-1, Sample 3-2은 정맥주사용 B형 간염 면역글로불린 제품이다. 온도 및 pH 변화에 따른 가혹조건의 영향을 확인하기 위해, 항온수조(PolyScience, IL, USA)를 사용하여 검체를 60o C에서 보관하였으며, pH 측정기(DE/Docu-pH plus, Sartorious, USA)로 pH를 조정하였다.

면역글로불린 중합물부정시험

고성능 액체크로마토그래피 시스템(Waters, MA, USA)에 연결된 친수성 실리카 겔 컬럼(7.5×600 mm, 10 μm)(TOSOH, Tokyo, Japan)을 사용하여 크기배제 액체크로마토그래피 분석을 수행하였다. 중합물부정시험 수행을 위한 시험 조건은 기존 연구와 동일하게 적용되었다.⁶⁾ 인산수소이나트륨이수화물(Na₂HPO₄·2H₂O) 4.873 g, 인산이수소나트륨일수화물(NaH₂PO₄·H₂O) 1.741 g, 염화나트륨(NaCl) 11.688 g 및 아지드화나트륨(NaN₃) 50 mg을 증류수 1L에 용해하여 이동상을 조제한다. 표준품 및 검체를 0.9 g/L 염화나트륨 용액으로 적절히 희석한 검액을 이동상을 사용하여 유속 0.5 mL/min으로 친수성 실리카 겔 컬럼에 흘려보낸다. 자외부흡광광도계를 사용하여 파장 280 nm에서 측정할 때, 표준품의 다이머 피크의 유지시간(retention time)을 모노머 피크의 유지시간으로 나누었을 때 약 0.85이어야 하며, 검체의 다이머 및 모노머 피크의 유지시간은 표준품의 다이머 및 모노머 피크의 유지시간 대비 1±0.02이어야 한다.

면역글로불린 항보체성부정시험

항보체성부정시험은 검체를 기니픽 보체와 반응시켜 보체가 불활화하지 않는 것을 확인하여 검체의 보체와의 결합성을 부정하는 시험방법으로, 생물학적제제 기준 및 시험방법 중 일반시험법의 항보체성부정시험법에 따라 시험하였다.⁷⁾ 요약하면 면양 적혈구에 Hemolysin을 혼합하여 감작 면양 적혈구를 조제하고, 100 CH₅₀/mL가 되도록 보체 희석액을 조제하였다. 표준품과 검체를 보체 희석액과 혼합하여 표준액과 검액을 조제하고, 검체 혹은 표준품을 포함하지 않는 대조액을 조제한다. 표준액 및 검액, 대조액을 단계 희석하여 시험액을 만들고 여기에 감작면양 적혈구를 넣어 반응시켰다. 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, WI, USA)를 사용하여 파장 541 nm에서 각 시험액의 흡광도를 측정하여 용혈도 및 보체가를 계산하고, 이를 이용해 보체소모량(%)을 산출하였다. 보체가(CH₅₀/mL)는 보체 희석배수를 50% 용혈시 희석된 보체 부피(mL) 및 적혈구 수 환산계수로 나누어서 산출하며, 보체소모량(%)은 대조액 보체가에서 검액 보체가를 뺀 값을 대조액 보체가로 나누어서 산출한다.

통계분석

모든 실험은 3번 반복 실험을 수행하였으며, 그 결과는 Microsoft Excel 2019 (Microsoft, WA, USA)를 사용하여 평균 및 표준편차를 산출하였다. 또한 Prism v8.4.3 software (GraphPad Software, Ca, USA)를 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 및 Bonferroni’s multiple comparisons test 사후검정을 수행하였으며, p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 분석하였다.

단백질 정제에서 바이러스 불활화 방법으로 60°C에서 열처리가 수행되며, 많은 단백질이 이 온도에서 응집하므로 응집체 형성의 제어가 중요하다.⁸⁾ 또한 면역글로불린과 같은 혈장분획제제는 공혈자 선별 및 혈액선별검사가 기본적으로 적용되지만, 혈장분획 공정 시 병원체의 불활화 과정 역시 매우 중요하다. 혈장 내 존재할 수 있는 바이러스는 나노여과법, 원심분리법 및 크로마토그래피법 등을 통해 물리적으로 제거하거나, 낮은 pH, solvent/detergent, 카프릴산 침전법 및 고열처리법 등을 통해 바이러스의 복제기능을 비활성화 시키는 방법으로 불활화 한다. 이중 60°C, 10시간 열처리를 하는 파스퇴르법(pasteurization)은 보편적으로 사용되고 있는 불활화 공정 중 하나이며, 열처리 시간조절 및 다양한 안정제 추가 등을 통해 이 방법의 효과를 증대하기 위한 시도와 검증이 지속적으로 수행되고 있다.^9-12) 이에 가혹조건 온도를 60°C로 설정하여 시험하였으며, 검체를 1시간 동안 60°C에서 보관한 예비실험에서 중합물부정시험 기준을 크게 초과하여(data not shown), 보관시간을 5, 10, 20분으로 설정하여 실험하였다. Sample 1, Sample 2-1, Sample 2-2, Sample 3-1, Sample 3-2를 20분 동안 60°C에서 보관 후 중합물부정시험을 수행한 결과, 모노머 및 다이머, 중합물의 함량은 각각 91.89, 85.75, 85.57, 99.52, 98.74% 및 8.11, 14.25, 14.43, 0.48, 1.26%로 나타났으며, 모든 검체에서 보관시간에 비례하여 중합물 생성이 증가하였다(Fig. 1(a). 온도 이외에 pH에 의한 중합물 생성 영향을 확인하기 위해, 온도 변화 실험에서 중합물이 가장 많이 생성된 Sample 2-2를 pH 7.0으로 조정한 후 보관시간을 5, 10, 20분으로 설정하여 중합물부정시험을 수행한 결과, 0, 5, 10분 검체의 중합물이 온도만을 가혹했을 때보다 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1(b). 중합물의 기원과 응집 과정에 따라 생성된 중합물이 제품의 품질에 영향을 미칠 수도 있고 그렇지 않을 수도 있기 때문에 중합물부정시험만으로는 품질관리에 충분하지 않다.¹³⁾ 이에 단순히 중합물의 함량 증가가 아닌 항보체성을 나타내는 중합물의 활성을 측정해보고자 중합물부정시험과 동일한 검체로 항보체성부정시험을 수행한 결과, 보관시간 20분 검체의 보체 소모량은 비가혹조건 대비 17.56, 22.05, 35.88, 16.72, 18.70% 증가하였으며, 중합물부정시험과 유사하게 모든 검체에서 보관시간에 비례하여 보체 소모량이 증가하였다(Fig. 2(a). 더욱이 Sample 2-2를 pH 7.0으로 조정하고 20분 동안 60°C에서 보관 후 항보체성부정시험을 수행한 결과, 보체 소모량이 pH만 조정했을 때도 비가혹조건 대비 22.32% 증가하였으며, 온도만을 가혹했을 때보다도 23.36% 증가한 것으로 나타났다(Fig. 2(b). 면역글로불린제제 중 존재하는 응집된 중합물 및 면역글로불린-지 Fc의 손상은 특정 항원의 개입 없이 보체 활성화 및 소비를 유발할 수 있다. 항원-항체 복합체와 같이 보체를 고정시키는 특이적인 성질은 Fc 결합력이 pH가 약산성일 때 약해지며, 중성 pH에서는 매우 강해지기 때문이다.^14,15,16) 본 가혹조건 연구를 통해 중합물의 보체 결합력은 산성 pH에서 낮고, 중성 pH에서는 높은 것을 확인할 수 있었으며, 중성 pH 응집체의 물리적 특성이 면역글로불린제제의 항보체성부정시험 결과에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.¹⁷⁾

Fig. 1. Results of molecular size distribution under stress conditions.
(a) Stress condition of 60°C were applied to all samples for 5, 10, and 20 min. (b) Additional stress condition of pH 7.0 were applied to Sample 2-2, which showed the highest polymers production at 60°C. ***p<0.001 (versus Normal group). ^###p<0.001 (versus pH 7.0 group).

Fig. 2. Results of anti-complementary activity under stress conditions.
(a) Stress condition of 60°C were applied to all samples for 5, 10, and 20 min. **p<0.01; ***p<0.001 (versus 0 min group). (b) Additional stress condition of pH 7.0 were applied to Sample 2-2, which showed the highest consumption of complement at 60°C. ***p<0.001 (versus Normal group). ^###p<0.001 (versus 60°C 20 min group).

본 연구를 통해 온도뿐만 아니라 pH가 면역글로불린제제의 항보체성을 나타내는 중합물 생성에 있어 중요한 기여요인임을 확인할 수 있었으며, 이에 제조공정에서 pH 변화를 최소화하여 제품의 안정성을 확보해야 할 것으로 판단된다. 또한 국가규제 기관에서 국가출하승인 검정시험을 수행할 때, 시약 조제 등과 같이 검체의 pH 변화에 영향을 미칠 수 있는 요인을 예측하고 이를 최소화하여 시험결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있을 것이다. 향후 분석 설계기반 품질고도화 기법(analytical quality by design)을 활용하여 면역글로불린제제의 품질관리 시험 중 주요 시험 특성에 영향을 미칠 수 있는 주요 시험 변수로 온도 및 pH를 포함하여 허용가능한 범위를 확인하는 추가 연구도 고려해볼 수 있을 것이다.

이 논문은 식품의약품안전처(과제번호 19201생물제261) 연구 개발비로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Ka Young Kim : Researcher

Jaeok Kim : Director

Kiwon Han : Assistant Professor, DVM, PhD

Chan Woong Choi : Scientific officer, DVM, PhD