대한민국약전(Korean Pharmacopoeia, KP)은 유럽약전(European Pharmacopoeia, EP)과 미국약전(United State Pharmacopoeia, USP), 일본약전(Japanese Pharmacopoeia, JP)과 함께 국제 약전에 해당한다. 본 약전에는 국내 개발 의약품의 품질 확보를 위한 표준규격과 시험법이 수록되어 있어 국가의 의약품 품질 기준을 지시하고 의약품 품질 입증 근거와 표준을 제시하는 역할을 한다.¹⁾

국제적으로 공인된 약전이지만 현재 국내에서 의약품을 공급하기 위해서는 대한민국약전의 미생물 시험법을 따라야 하고 유럽 연합과 미국에 의약품을 수출하기 위해서는 각각 유럽약전과 미국약전의 가이드를 따라야 하는 번거로움이 있다. 국제약전의 미생물 시험법으로는 무균시험법(KP, EP, USP), 미생물한도 시험법(KP, EP, USP), 항생물질의 미생물학적 역가시험법(KP, EP, USP), 보존력시험법(KP, EP, USP), 엔도톡신시험법(KP, EP, USP), 마이코플라즈마시험법(EP, USP), 정제수시험법(EP), 미생물 신속동정 시험법(EP)이 있다.²⁾

국내의 대표적인 미생물 또는 병원체균주 보존 기관으로 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens, NCCP)이 있음에도 불구하고 국내 의약품 개발이나 품질관리를 위한 미생물 시험법에 사용되는 시험용 균주를 국외 전문 균주보존기관(American Type Culture Collection, ATCC (USA); National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria, NCIMB (UK); National Collection of Type Cultures, NCTC (UK), Collection de I’Institut Pasteur, CIP (France); NITE Biological Resource Center, NBRC (Japan)을 통해 해외구매를 하고 있기에 높은 수입 의존도(약 70~88.7%)와 경제적 비용 부담(국외 병원체 구입비 12.5억)이라는 문제가 있다. 또한 생명연구 자원의 자국화와 나고야의정서 발효로 인한 이익공유로 미생물자원의 경제적 가치에 따른 추가적인 어려움도 있다.^3-4)

지난, 2014년부터 대한민국약전 미생물 시험법 중 항생물질의 미생물학적 역가시험범에 사용되는 Escherichia coli NIHJ 균주의 수급이 어려워 국가병원체자원은행의 E. coli NCCP 14134 균주를 사용할 수 있도록 고시한 바 있어 이후 국내 균주 자원활용 근거를 마련하는 대체균주 개발 연구를 진행하였으나 최근 약전 개정판에는 반영되지 않았다.^5-7)

본 연구에서는 대한민국약전 일반시험법에 기재되어 있는 미생물 시험법 가운데 의약품의 무균상태를 확인하기 위해 세균 및 진균을 검출하는 무균시험법과 호기 조건에서 증식하는 세균과 진균을 정량적으로 측정하는 생균수시험, 원료나 제제에 특성미생물이 존재하지 않거나 그 존재가 한정적인지 이미 정해진 미생물학적 품질 규격에 적합한 지 여부를 판정하는 특정 미생물시험의 미생물한도시험법에서 사용되고 있는 국외 균주에 대해 국내 분리 균주와 비교하여 동등성을 확인하고자 하였다(Table 1).

Table 1

Korean Pharmacopoeia (KP)-listed cultures for official compendial microbiological tests

Species/Strain No. Tests	Species
	Staphylococcus aureus	Pseudomonas aeruginosa	Bacillus subtilis	Clostridium sporogenes	Escherichia coli	Salmonella Typhimurium	Candida albicans	Aspergillus brasiliensis (A. Niger)
Sterility Tests	ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP4.83, NBRC 13276, NCTC 10788 or KCTC 3881	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 or KCTC 2513	ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, NBRC 3134 or KCTC 1021	ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATCC 11437, NBRC 14293	-	-	ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, NBRC 1594 or KCTC 7965	ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, NBRC 9455, KCTC 6317 or KCTC 6196
Microbiological Examination of Non-sterile Products: Viable Cell Count	ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 or KCTC 3881	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 or KCTC 2513	ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, NBRC 3134 or KCTC 1021	-	-	-	ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, NBRC 1594 or KCTC 7965	ATCC 16404, IMI 149007, IP 1431.83, NBRC 9455, KCTC 6317 or KCTC 6196
Microbiological Examination of Non-sterile Products: Tests for specified microorganisms	ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP4.83, NBRC 13276 or KCTC 1927	ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275 or KCTC 2513	-	-	ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, NBRC 3972 or KCTC 2571	ATCC 14028 or NBRC 100797, NCTC 6017 or CIP 80.39	ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, NBRC 1594 or KCTC 7965	-

이 시험법들에 표기된 국내 균주는 생물자원센터에 등재된 자원, 즉, Staphylococcus aureus KCTC 3881(=KCTC 1927←ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa KCTC 2513(←ATCC 9027), Bacillus spizizenii KCTC 1021(←ATCC 6633), Escherichia coli KCTC 2571(←ATCC 8739), Candida albicans KCTC 7965(←ATCC 10231), Aspergillus brasiliensis KCTC 6317(=KCTC 6196 ←ATCC 16404)로 현재 일부 자원만 확보가 가능하고, 모두 국외 전문 생물자원센터 유래 자원이며 대한민국약전에서만 인정된다(Table 1).

그러나, 국제 제약 산업 시장이 커지고 국내 제약회사들의 해외진출과 인지도가 높아지는 현재 시장 상황을 감안하였을 때 국내 개발 의약품이 국제 승인을 위해 대한민국약전 이외에 미국, 유럽, 일본 등 선진국의 국제 약전의 원료, 기준, 시험방법의 입증자료를 별도로 준비해야 하는 번거로움이 있고 수출에 걸림돌이 있기에, 관련 부처는 국내 필수의약품 생산 독려, 품질 경쟁력 강화 및 수출 지원 기반을 마련하기 위해 그 기준을 국제 기준에 맞추거나 선진화 하기 위해 노력하고 있다.⁸⁾

특히, 질병관리청 국가병원체자원은행은 국내에서 분리된 병원성 균주를 수집하여 그 품질과 특성 확인한 후 균주를 자원화하여 백신·치료제·진단제 개발 연구의 감염병 대응 원천물질과 식·의약품 및 화장품 등 보건의료 산업 분야에 매년 약 3,000 주 이상을 분양하고 있다.^9-11)

또한, 국가 병원체자원 책임기관으로서 은행에서 보유하고 있는 국내 균주들의 균종별 특성 분석 체계를 마련하여 대한민국약전 등 국가시험 인증서의 미생물 시험법의 참조균주로 적용하는 등 자원의 유용화와 고부가가치화를 위해 노력하고 있다.

본 연구에서는 무균시험법과 미생물한도시험법의 시험균종 가운데 균종 5종(Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans)에 대하여 국가병원체자원은행에 등재된 균주들의 품질을 확인하고 후보주 각 한 주에 대해 분자생화학적 특성 및 유용성 분석을 실시하여 참조균주와의 동등성을 확인하였다.

이를 통해 의약품 개발 시 필요한 일반시험법에 적용되는 참조균주를 국산 미생물 균주로 대체 또는 병행 표기하여 제제 및 원료품을 포함한 비무균제품의 미생물학적 품질을 평가하는데 연구자들에게 편의성을 제공하고 국내 균주의 활용도를 높이고자 한다.

1. 분석에 사용된 시험 균주

본 연구에서는 대한민국약전에 등재되어 미생물시험의 국외 참조균주로 사용되는 ATCC 자원인 Staphylococcus aureus ATCC 6538, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Bacillus subtilis ATCC 6633 (syn. Bacillus spizizenii), Clostridium sporogenes ATCC 19404, Escherichia coli ATCC 8739, Salmonella Typhimurium ATCC 14028, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404를 사용하였으며, 사용된 참조균주는 미국 ATCC에서 구입하였다.

또한, 현재 약전 미생물한도 시험법 특정미생물시험, 미생물한도 시험법 생균수시험과 무균시험법에 등재되어 있는 국외 참조균주와 비교하기 위해 우선 국가병원체자원은행(NCCP)에 보유 등재된 자원 50-100주에 대한 항생제 정보 등을 수집하여 1차로 선정하였고 참조균주와 유의성이 높은 국내 분리 균주 Staphylococcus aureus NCCP 11854, Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783, Escherichia. coli NCCP 12480, Salmonella Typhimurium NCCP 16345, Candida albicans NCCP 31538주 5종 5주를 선정하여 분자생화학적 특성과 유용성 분석을 수행하였다(Table 2).

Table 2

Five KP-listed reference and Korean strains (ATCC/NCCP) compared equivalence and usefulness in General Microbial tests

Species	Three General Tests and Strian No.
	Sterility Tests	Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests	Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms Tests
Staphylococcus aureus	ATCC 6538/NCCP 11854	ATCC 6538/NCCP 11854	ATCC 6538/NCCP 11854
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027/NCCP 15783	ATCC 9027/NCCP 15783	ATCC 9027/NCCP 15783
Escherichia coli	-	-	ATCC 8739/NCCP 12480
Salmonella Typhimurium	-	-	ATCC 14028/NCCP 16345
Candida albicans	ATCC 10231/NCCP 31538	ATCC 10231/NCCP 31538	ATCC 10231/NCCP 31538

2. 시험 균주 배양 및 동정

국내 분리주 각각 세균 4종과 진균 1종, S. aureus NCCP 11854, P. aeruginosa NCCP 15783, E. coli NCCP 12480, S. Typhimurium NCCP 16345, C. albicans NCCP 31538과 국외참조균주 S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 9027, E. coli ATCC 8739, S. Typhimurium ATCC 14028, C. albicans ATCC 10231에 대하여 무균시험법(Sterility test)과 미생물한도 시험법(Microbiological Examination of Non-sterile Products)의 생균수시험(Microbiological Examination of Non-sterile Products: Viable Cell Count)과 특정미생물시험(Microbiological Examination of Non-sterile Products: Tests for specified microorganisms)을 위해 5번 이하로 계대하여 증폭 배양을 실시 하였다. 균주 동정은 VITEK-2 GP ID card (bioMerieux, USA)와 질량분석시스템(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass, MALDI-TOF MS, Bruker Daltonik, USA) 매뉴얼을 사용하여 분석하였다.^12-14)

3. 분자생물학적 및 생화학적 특성 분석

1) 16S and ITS gene analysis sequencing

각 균주별 분석에 사용한 증폭 프라이머와 조건은 다음과 같다. S. aureus, P. aeruginosa, E. coli와 S. Typhimurium의 16S rRNA 유전자 증폭을 위해 universal primer인 27F(5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R(5'-CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT-3')를 사용하여 PCR을 수행하였고 C. albicans의 ITS 유전자 부위는 분석을 위하여 universal primer인 ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')과 ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하여 유전자를 증폭하여 각 균주의 참조균주와 후보균주의 염기서열을 비교하고 global alignment 실행시켜 유전적 상동성을 백분율로 확인하여 동정하였다(EZBIOCLOUD (https://www.ezbiocloud.net)).¹⁵⁾ 또한, 곰팡이 유전자 18S와 28S rRNA 사이의 보존 영역인 ITS 영역을 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭 및 서열 분석하였다. 표적 증폭은 Prime TaqPrimix^® 10μL (GeNet Bio, Daejeon, S. Korea), 증류수 5 μL, 각 프라이머(10 pmol/μL) 및 gDNA 템플릿 3 μL를 포함하는 시퀀싱 반응 혼합물 20 μL에서 수행하였다. 중합효소연쇄반응(PCR) 조건은 94°C에서 1분간 변성, 94°C에서 30초간 후속 변성의 30주기, 57°C에서 30초간 어닐링 및 72°C에서 45초간 연장 후 72°C에서 7분간 최종 연장반응을 실시하였다.

2) 독소 유전자 검출시험(응집 시험법 또는 다중유전자증폭)

S. aureus의 독소 유전자 TSST (Toxic Shock Syndrome toxin), EXT (Exfoliative toxin), SET (Enterotoxin)의 분석을 응집 시험법으로 수행하였다 (Staphylococcal Coagulase Antisera, Cat no. 270016, Denka-Seiken, JAPAN). 미생물성장배지(Brain Heart Infusion, BHI)에 37°C, 120 rpm 조건에서 하루 동안 배양한 후, 원심분리를 수행하고 상등액을 취하여 96 well plate에 25 μL를 넣고 2배수 희석 과정을 거쳐 1/16까지 희석하였다. 독소 감응성 라텍스를 넣어주어 진동이 없는 상온에서 하루 동안 배양한 후 응집 여부를 확인하였다.

P. aeruginosa의 독소 유전자 toxA (exotoxin A)와 exoenzyme (exoS, exoT, exoU, exoY) 검출시험을 위해 분석 조건에 따라 다중 유전자를 증폭시험법 (Multiplex PCR kit ver 2, TaKaRa, RR062A, Tokyo, Japan)으로 분석하였다(Table 3). E. coli의 독소 유전자 검출시험을 위해 Multiplex PCR kit를 사용하여 9종의 병원성 대장균 독소형인 VT1 (stx1), VT2 (stx2), LT, ST (sth/stp), eaeA, bfpA, aggR, ipaH를 분석하였다(Table 4).

Table 3

Toxic genes and their primers for Pseudomonas aeruginosa

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
toxA	F	ATGGTGTAGATCGGCGACAT	375
	R	AAGCCTTCGACCTCTGGAAC
exoY	F	TCCAAGCTTATGCGTATCGACGGTCATC	276
	R	GTATCGATCCGAGGGGGGTGTATCTGACC
exoS	F	TCAGGTACCCGGCATTCACTACGCGG	213
	R	TCACTGCAGGTTCGTGACGTCTTTCTTTTA
exoT	F	AGAACCCGTCTTTCGTGGCTGAGTT	688
	R	CAGCTCGCTCGCCTTGCCAAGT
exoU	F	CCTTAGCCATCTCAACGGTAGTC	510
	R	GAGGGCGAAGCTGGGGAGGTA

Table 4

Toxic genes and their primers for Escherichia coli

Pathogenic	Target genes	Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
EHEC	stx1	CGTCTTTACTGATGATTGATAGTGGC	637
		CGCGATGCATGATGATGAC
	stx2	TACCACTCTGCAACGTGTCG	297
		CGATACTCCGGAAGCACATT
EPEC	eaeA	CGGCGATTACGCGAAAGA	248
		CCTAAATTTGCCGTAAAGCGG
	bfpA	AGAATGCTATTTCAGAAGTAATGAGCG	400
		TTACATGCAGTTGCCGCTTC
ETEC	lt	GTACTTCGATAGAGGAACTCAAATGAATAT	530
		ATTCTGGGTCTCCTCATTACAAGTATC
	sth	TTCGCTCAGGATGCTAAACCA	167
		TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
	stp	TCTTTCCCCTCTTTTAGTCAG	165
		ACAGGCAGGATTACAACAAAG
EAEC	aggR	TTAAAATAAGTCAARAATTGTTTTGGTGTTA	715
		ATTATAAAAATTAACAATATCAGAATACATCAGTACAC
EIEC	ipaH	CCTTTTCCGCGTTCCTTGA	104
		CAGCAGCAACAGCGAAAGAC

3) 다좌위서열형별 분석(Multilocus Sequence Typing, MLST)

5종에 대하여 각각 균주별로 Enright 등(2000)¹⁶⁾에 의해 기술된 방법에 따라 5-7개의 house-keeping gene을 선정하여 증폭하고 그 절편을 서열 분석 한 후 대립유전자(allele) 번호의 조합과 염기서열 형(Sequence type, ST)을 데이터베이스(PubMLST, https://pubmlst.org)에 입력하여 분석하였다.

S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, S. Typhimurium과 C. albicans 모두 각각 7개 지표 유전자를 사용하여 각 유전자 증폭 조건에 따라 분석하였다(Table 5~9).

Table 5

Target genes and their primers for Staphylococcus aureus

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
aroC	F	TTGATTCACCAGCGCGTATTGTC	456
	R	AGGTATCTGCTTCAATCAGCG
aroE	F	ATCGGAAATCCTATTTCACATTC	456
	R	GGTGTTGTATTAATAACGATATC
glpF	F	CTAGGAACTGCAATCTTAATCC	465
	R	TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC
gmk	F	ATCGTTTTATCGGGACCATC	429
	R	TCATTAACTACAACGTAATCGTA
pta	F	GTTAAAATCGTATTACCTGAAGG	474
	R	GACCCTTTTGTTGAAAAGCTTAA
tpi	F	TCGTTCATTCTGAACGTCGTGAA	402
	R	TTTGCACCTTCTAACAATTGTAC
yqiL	F	CAGCATACAGGACACCTATTGGC	516
	R	CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC

Table 6

Target genes and their primers for Pseudomonas aeruginosa

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
acsA	F	ACCTGGTGTACGCCTCGCTGAC	842
	R	GACATAGATGCCCTGCCCCTTGAT
aroE	F	TGGGGCTATGACTGGAAACC	825
	R	TAACCCGGTTTTGTGATTCCTACA
guaA	F	CGGCCTCGACGTGTGGATGA	940
	R	GAACGCCTGGCTGGTCTTGTGGTA
mutL	F	CCAGATCGCCGCCGGTGAGGTG	940
	R	CAGGGTGCCATAGAGGAAGTC
nuoD	F	ACCGCCACCCGTACTG	1,042
	R	TCTCGCCCATCTTGACCA
ppsA	F	GGTCGCTCGGTCAAGGTAGTGG	989
	R	GGGTTCTCTTCTTCCGGCTCGTAG
trpE	F	GCGGCCCAGGGTCGTGAG	811
	R	CCCGGCGCTTGTTGATGGTT

Table 7

Target genes and their primers for Escherichia coli

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
adk	F	ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG	583
	R	CCGTCAACTTTCGCGTATTT
	F1	TCATCATCTGCACTTTCCGC
	R1	CCAGATCAGCGCGAACTTCA
fumC	R1	TCCCGGCAGATAAGCTGTGG	806
	F	TCACAGGTCGCCAGCGCTTC
	R	GTACGCAGCGAAAAAGATTC
gyrB	F	TCGGCGACACGGATGACGGC	911
	R1	GTCCATGTAGGCGTTCAGGG
	R	ATCAGGCCTTCACGCGCATC
icd	F	ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA	878
	R	GGACGCAGCAGGATCTGTT
mdh	F	ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG	932
	R	TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTT
	F1	AGCGCGTTCTGTTCAAATGC
	R1	CAGGTTCAGAACTCTCTCTGT
purA	F1	TCGGTAACGGTGTTGTGCTG	816
	F	CGCGCTGATGAAAGAGATGA
	R	CATACGGTAAGCCACGCAGA
recA	R1	AGCGTGAAGGTAAAACCTGTG	780
	F	CGCATTCGCTTTACCCTGACC
	F1	ACCTTTGTAGCTGTACCACG
	R	TCGTCGAAATCTACGGACCGGA

Table 8

Target genes and their primers for Salmonella Typhimurium

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
thrA	F	GTCACGGTGATCGATCCGGT	852
	R	CACGATATTGATATTAGCCCG
	R1	GTGCGCATACCGTCGCCGAC
purE	F	ATGTCTTCCCGCAATAATCC	510
	F1	GACACCTCAAAAGCAGCGT
	R	TCATAGCGTCCCCCGCGGATC
	R1	CGAGAACGCAAACTTGCTTC
	R	2 AGACGGCGATACCCAGCGG
sucA	F	AGCACCGAAGAGAAACGCTG	643
	F1	CGCGCTCAAACAGACCTAC
	R	GGTTGTTGATAACGATACGTAC
	R1	GACGTGGAAAATCGGCGCC
hisD	F	GAAACGTTCCATTCCGCGCAGAC	894
	F1	GAAACGTTCCATTCCGCGC
	R	CTGAACGGTCATCCGTTTCTG
	R1	GCGGATTCCGGCGACCAG
aroC	F	CCTGGCACCTCGCGCTATAC	826
	R	CCACACACGGATCGTGGCG
hemD	F	ATGAGTATTCTGATCACCCG	666
	F1	GAAGCGTTAGTGAGCCGTCTGCG
	R	ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA
dnaN	F	ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA	833
	R	AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC
	R1	CCGCGGAATTTCTCATTCGAG

Table 9

Target genes and their primers for Candida albicans

Target genes		Primer sequences (5'→3')	Size (bp)
AAT1a	F	ACTCAAGCTAGATTTTTGGC	478
	R	CAGCAACATGATTAGCCC
ACC1	F	GCAAGAGAAATTTTAATTCAATG	519
	R	TTCATCAACATCATCCAAGTG
ADP1	F	GAGCCAAGTATGAATGATTTG	537
	R	TTGATCAACAAACCCGATAAT
PMIb	F	ACCAGAAATGGCCATTGC	486
	R	GCAGCCATGCATTCAATTAT
SYA1	F	AGAAGAATTGTTGCTGTTACTG	543
	R	GTTACCTTTACCACCAGCTTT
VPS13	F	TCGTTGAGAGATATTCGACTT	741
	R	ACGGATGGATCTCCAGTCC
ZWF1b	F	GTTTCATTTGATCCTGAAGC	702
	R	GCCATTGATAAGTACCTGGAT

4) 항원‧항체응집반응 실험을 통한 특이 항원 및 혈청형 분석

S. aureus의 혈청형 분석을 위해 실험 하루 전 혈액한천배지(Blood Agar Plate, BAP)에 균주를 4분 도말한 후 16-24시간 배양하여 단일 콜로니가 생기도록 하였다. 증식된 균주 집락을 수확하여 원심분리와 균질화 과정을 거쳐 핵산(DNA)을 추출하였다(KingFisher Duo Prime purification system, Thermo Scientific, Cat. 5400110, USA). 추출된 DNA를 CoA gene PCR 조건에 증폭 산물 5 μL에 제한효소 Nde I를 처리하여 DNA 단편 패턴과 유형을 PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)법을 사용하여 확인하였다.

P. aeruginosa의 혈청형 분석을 위해 BAP에 균주를 4분 도말한 후 16~24시간 배양하여 단일 콜로니가 생기도록 하였고 P. aeruginosa Antisera (Denka kit, Cat. 294616, JAPAN)를 사용하여 혈청형 A-N을 분석하였다. 슬라이드에 혈청을 1방울 떨어뜨린 후, 37°C 배양기에서 16-24시간 배양한 균의 단일 콜로니를 취해서 혈청에 완전히 풀어주었다. 응집반응을 확인하기 위해 약 1분간 inverting을 수행한 뒤 응집 여부를 확인하였다.

E. coli의 O 항원 확인을 위해 균주를 0.85% NaCl saline solution with sodium azide 2 mL에 McFarland 6으로 현탁하고 1시간 동안 95°C에서 배양한 후 2 mL formalinized SS containing gentian violet (0.005% w/v) 2 mL 튜브에 넣어 냉각시키고, 항혈청을 종류에 맞게 희석한 후, 균액을 96 well V bottom plate에 1번부터 12번까지 1/2 단계 희석한 후 희석시킨 항혈청을 첨가하여 37°C 24시간 배양한 후 항원-항체 응집반응을 확인하였다.

S. Typhimurium종은 3개 항원의 혈청형을 분석하였다. 먼저 O항원을 확인하기 위해 슬라이드에 혈청(다가)을 떨어뜨리고 집락을 취하여 항혈청과의 응집반응을 확인하였다. 다가항원과 응집이 확인되면, A, B, C, D, E 각 그룹에서 해당되는 O 항원그룹 진단용 혈청과 반응시켜 O 그룹을 확인하여 기록하였다.

H1 항원을 확인하기 위해 Motility GI medium (DifcoTM, REF 286910, BD, USA) 에서 배양한 살모넬라균의 일부를 veal infusion broth (DifcoTM, REF 234420, BD, USA)에 재접종하여 37°C에서 16-24시간 동안 배양한 후 다음날 포르말린 생리식염수(0.6% 포르말린) 동량(5 mL)을 배양액에 넣어 균을 비활성화시켰다. H 항혈청을 종류에 따라 알맞게 희석한 후, 5 mL 튜브에 항원과 Spicer Edward (SE, 1-4), L complex, G complex, z4 complex를 각 500 μL씩 분주하여 50°C 항온수조에서 1-2시간 반응시킨 후 응집여부를 확인하였다.

H2 항원을 확인하기 위해 H1의 항원시험에서 확인된 항원의 농축액 20μL를 녹인 Motility GI medium (DifcoTM, REF 286910, BD, USA)에 떨어뜨리고 잘 교반 한 후, 항혈청을 넣은 배지는 냉각시켜 굳힌 후 균주를 접종하고 37°C에서 16-24시간 배양하였다. 아래로 내려가며 자라는 것이 확인되면 phage 2가 있는 것이므로 아래로 자란 살모넬라균의 덩어리 일부를 5mL veal infusion broth (DifcoTM, REF 234420, BD, USA)에 재접종하여 37°C에서 16-24시간 동안 배양하였다. 다음날 포르말린 생리식염수(0.6% 포르말린) 동량(5 mL)을 배양액에 넣은 후 균을 비활성화시키고 5 mL 튜브에 항원과 L complex, 1 complex, EN complex, z6를 각 500 μL씩 분주하여 50°C 항온수조에서 1-2시간 반응시킨 후 응집 여부를 확인하여 판독했다. 각 항원 응집반응에 대한 판독 결과는 Kauffman-White Scheme을 따랐다.¹⁷⁾

5) 항생제 감수성 시험(디스크확산법 또는 최소억제농도검사법)

항생제 감수성 분석은 각 종별로 디스크확산법(Disk diffusion method), 최소억제농도 검사법(Minimum inhibitory concentration (MIC), Commercial Sensititre kit)을 채택하여 수행하였고 CLSI 가이드라인의 기준에 따라 감수성을 판정하였다.¹⁸⁾ 또한, 각 균주 종별로 항생제 및 항진균제 감수성 분석을 실시하였다. S. aureus종에 대한 항생제 감수성 분석은 penicillin, tetracycline, ciprofloxacin, erythromycin, oxacillin, cefoxitin 6종의 항생제디스크(BD-231321, -231344, -231658, -231290, -231319, -231591, BD difco, NY, USA)를 사용하여 수행하였으며, 억제대 크기를 측정하여 감수성을 판정하였다(Table 10).

Table 10

Antimicrobial susceptibility analysis criteria for S. aureus (Disk diffusion method, CLSI guideline)

Antimicrobial	Disk Content	Zone Diameter Breakpoints
		(nearest whole mm)
		S	I	R
Penicillin	10 units	≥29	-	≤28
Tetracyclin	30 μg	≥19	15~18	≤14
Ciprofloxacin	5 μg	≥21	16~20	≤15
Erythromycin	15 μg	≥23	14~22	≤13
Oxacilin	1 μg	≥13	11~12	≤10
Cefoxitin	30 μg	≥22	-	≤21

P. aeruginosa 종에 대한 항생제 감수성 분석은 gentamicin, tobramycin, cefepime, imipenem, ceftazidime, piperacillin/tazobactam 6종의 항생제디스크(BD-231299, -231569, -231696, -231645, -231633, -231692, BD difco, NY, USA)를 사용하여 수행하였고 억제대 크기를 측정한 후 감수성을 판정하였다(Table 11).

Table 11

Antimicrobial susceptibility analysis criteria for P. aeruginosa (Disk diffusion method, CLSI guideline)

Antimicrobial	Disk Content	Zone Diameter Breakpoints
		(nearest whole mm)
		S	I	R
Cefepime	30 μg	≥18	15~17	≤14
Gentamycin	10 μg	≥15	13~14	≤13
Imipenem	10 μg	≥19	16~18	≤15
Tobramycin	10 μg	≥15	13~14	≤13
Piperacillin/Tazobactam	100/10 μg	≥21	15-20	≤14
Ceftazidime	30 μg	≥18	15~17	≤14

E. coli 종에 대한 항생제 감수성 분석은 항균제 패널, Sensititre KRNV5F 패널과 KORN 패널(TREK Diagnostic Systems, Westlake, OH, USA)을 사용하여 microdilution 방법에 따라 MIC 값을 확인하였다. 모두 9개 계열 15개 항균제에 대하여 진행하고 MIC 값을 확인하였다(Table 12).

Table 12

Antimicrobial susceptibility analysis criteria for E. coli (MICs, CLSI guideline)

Antimicrobial	MICs (ug/mL)
	S	I	R
Amoxicillin/clavulanic acid	S≤8/4	I =16/8	R≥32/16
Cefepime	S≤2	I =4-8	R≥16
Cefoxitin	S≤8	I =16	R≥32
Trimethoprim/sulfamethoxazole	S≤2/38	-	R≥4/76
Chloramphenicol	S≤8	I =16	R≥32
Ampicillin	S≤8	I =16	R≥32
Ciprofloxacin	S≤0.25	I =0.5	R≥1
Gentamicin	S≤4	I =8	R≥16
Ceftazidime	S≤4	I =8	R≥16
Tetracyclin	S≤4	I =8	R≥16
Sulfisoxazole	S≤256	-	R≥512
Nalidixic Acid	S≤16	-	R≥32
Meropenem	S≤1	I =2	R≥4
Ertapenem	S≤0.5	I =1	R≥2
Imipenem	S≤1	I =2	R≥4
Meropenem	S≤1	I =2	R≥4
Doripenem	S≤1	I =2	R≥4

또한 항균제 내성유전자 증폭 시험을 통해 carbapenemase 및 bata-lactamase 내성유전자의 종류와 존재 유무를 확인하여 항생제 내성을 확인하였다(Table 13, 14).

Table 13

Genes related to carbapenemase and their amplification condition

Target genes	Primers	Size (bp)	Sequences (5'→3')	Amplification condition
blaKPC	KPC F	893	ATGTCACTGTATCGCCGTCT	94°C 5 min+30X (94°C 30 sec+56°C 20 sec+72°C 30 sec)+72°C 7 min
	KPC R		TTTTCAGAGCCTTACTGCCC
blaGES	GES F	753	GCGCTTCATTCACGCACTAT
	GES R		GCGTAATCTCTCTCCTGGGC
blaNDM-1	NDM-1 F	726	CAATATTATGCACCCGGTCG
	NDM-1 R		ATCATGCTGGCCTTGGGGAA
blaIMP-1	IMP F	740	TGAGCAATGTATCTGTATTC
	IMP R		TTAGTTGCTTGGTTTTGATG
blaVIM	VIM F	766	TGGTCTACATGACCGCGTCT
	VIM R		CGACTGAGCGATTTGTGTG
blaOXA-48	OXA-48 F	744	TTGGTGGCATCGATTATCGG
	OXA-48 R		GAGCACTTCTTTTGTGATGGC

Table 14

Genes related to beta-lactamase and their amplification condition

Target genes	Primers	Size (bp)	Sequences (5'→3')	Amplification condition
blaTEM	TEM F	861	ATGAGTATTCAACATTTCCGT	94°C 5 min+35X (94°C 30 sec+59°C 30 sec+72°C 30 sec)+72°C 7 min
	TEM R		TTACCAATGCTTAATCAGTGA
blaSHV	SHV F	927	CCGGGTTATTCTTATTTGTCGCT	94°C 5 min+35X (94°C 30 sec+61°C 30 sec+72°C 30 sec)+72°C 7 min
	SHV R		TAGCGTTGCCAGTGCTCG
blaCTX-M	CTXM-1 F	819	ACCGTCACGCTGTTGTTAGG	94°C 5 min+30X (94°C 30 sec+56°C 20 sec+72°C 40 sec)+72°C 7 min
	CTXM-1 R		CAAGGTGACGATTTTAGCCG
	CTXM-2 F	844	AATGTTAACGGTGATGGCGA
	CTXM-2 R		ACCGTGGGTTACGATTTTCG
	CTXM-9 F	845	GTGCAACGGATGATGTTCG
	CTXM-9 R		ATGATTCTCGCCGCTGAAG
	CTXM-25 F	856	GTAAGGCGGGCGATGTTAAT
	CTXM-25 R		AACCGTCGGTGACAATTCTG
blaCMY	MOXM F	520	GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT	94°C 5 min+30X (94°C 30 sec+56°C 20 sec+72°C 1 min)+72°C 7 min
	MOXM R		CACATTGACATAGGTGTGGTGC
	CITM F	462	TGGCCAGAACTGACAGGCAAA
	CITM R		TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC
blaDHA	DHAM F	405	AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT
	DHAM R		CCGTACGCATACTGGCTTTGC
mcr-1	CRL5-F	309	CGGTCAGTCCGTTTGTTC	94°C 5 min+30X (94°C 30 sec+58°C 90 sec+72°C 1 min)+72°C 7 min
	CRL5-R		CTTGGTCGGTCTGTAGGG

S. Typhimurium종에 대한 항생제 감수성 분석은 항균제 패널, Sensititre KRNV5F 패널, KORN 패널과 AMRGN1 패널(TREK Diagnostic Systems, Westlake, OH, USA)을 사용하여 microdilution 방법에 따라 MIC 값을 확인하였다.

C. albicans종에 대한 항진균제 감수성 분석은 항진균제 패널로 Sensititre Yeast One 패널(TREK Diagnostic Systems, Westlake, OH, USA)을 사용하여 microdilution 방법에 따라 MIC값을 확인하였다.

균주별로 측정된 MIC 값을 CLSI 가이드라인에서 제시한 기준에 대입하여 감수성 및 내성을 판독하였다.¹⁸⁾

4. 국내 균주 5종에 대한 동등성 비교 분석(Equivalence analysis of Microbiological Methods using Five NCCP Strains)

1) 시험균 희석배수 확인

(1) 시험방법

각 접종균은 C. albicans NCCP 31538, C. albicans ATCC 10231, E. coli NCCP 12480, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa NCCP 15783, P. aeruginosa ATCC 9027, S. Typhimurium NCCP 16345, S. Typhimurium ATCC 14028, S. aureus NCCP 11854, S. aureus ATCC 6538이며 각 균주는 5세대 이내 배양하여 준비하였다. 균마다 적정 희석배수가 다르므로, 5종에 대해 각각 실험하였다.

McFarland 탁도계를 사용하여 0.5를 맞춘 후 (보통 1-2X108 CFU/mL), 계단 희석하여 Tryptic Soy Agar (TSA, MB-T1052-P50, Lot No.: R3041101HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea) 또는 Sabouraud Dextrose (SD, MB-S1527-P50, Lot No.: R3041141HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea) Agar에 0.1 mL를 도말하여 배양하였다.

세균은 30-35°C에서 18-24시간, 진균은 20-25°C에서 2-3일 배양하고 배양 결과는 사진으로 기록, 계수하여 100 CFU 이하인지 확인하였다. 배양 결과가 100 CFU 이상일 경우 희석배수를 바꿔 재시험하였고, 100 CFU 이하로 나오는 적정 희석배수를 확인하여 기록 후 실험에 사용하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

2) 무균시험법 유용성 분석

국내 균주와 국외 참조균주 모두 5세대 이하로 계대 배양된 균주를 사용하였다.

(1) 배지 무균시험(Sterility Test)

배지는 생산, 유통 및 보관상 미사용 배지에서 오염 여부를 판단하였고 무균상태로 생산됨을 증명하기 위해 시험하고 관찰하였다. 배양목적에 따라 제시된 온도(20-25, 30-35°C)에서 호기 또는 혐기조건에서 14일간 배양하여 오염 여부를 관찰하였다. 샘플 수는 무작위로 5개를 각각 선택하여 20-25, 30-35°C에서 검사를 진행하였고 14일 후 미생물의 증식이 관찰되지 않으면 적합으로, 증식이 보이면 부적합으로 판정하였다.

(2) 배지 적합성 시험(Growth Promotion Test)

분석에 사용되는 제품에 국내 균주와 국외 참조균주의 증식을 확인한 후, 배지가 포함하고 있는 영양성분에 따른 접종 균의 증식 및 억제 여부를 관찰하여 배지의 적합성을 확인하였다. 배지에 국내 균주 및 국외 참조균주를 100 CFU 이하로 접종한 후 배양하여 증식 여부를 확인하였고 액체배지의 경우 증식 촉진은 육안으로 탁도를 식별하여 사진으로 기록하였으며, 600 nm에서 OD (Optical Density)값 측정이 가능한 대두카제인액체배지(Tryptic Soy Broth, TSB)의 경우, 그 값을 시간대별로 기재하였다.

또한, 배지 성능이 확인된 대두카제인한천배지(Tryptic Soy Agar, TSA) 또는 사브로포도당한천배지(Sabouraud Dextrose, SD Agar)에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였고, 현탁액은 일반적으로 2시간 이내에 하였으나, 2-8°C에 보관한 경우에는 24시간 이내에 사용하였다.

(3) 측정법 적합성 시험

검체 존재 하에서 균주의 성능을 비교하기 위해 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 하였다. 이 경우 배지 적합성 시험과 측정법의 적합성 시험을 동시에 진행할 수 있다.

- 대두카제인액체배지(Tryptic Soy Broth, TSB)

우선 TSB 배지 10mL에 국내 균주 C. albicans NCCP 31538 및 국외 참조균주 C. albicans ATCC 10231에서 동일한 CFU 값을 측정(100 CFU 이하)하여 검체 대용으로 생리식염수를 같이 접종하였다. 다른 TSB 배지 10mL에는 희석액만 접종하여 음성대조군으로 하였으며 양성대조군으로 배지적합성 시험을 하였다. 검체의 항균 활성 시험은 검체를 생리식염수로 대신하기 때문에 증식은 육안으로 확인하였고, OD값 측정이 가능한 TSB배지의 경우, OD값은 600 nm에서 시간대별로 기재하였다. 대상균주는 진균이므로 5일 동안 배양하였다.

배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 각각의 균주를 접종한 샘플에서 24시간마다 OD값을 측정하여 기록하였으며, 5일 이내 육안으로 선명한 증식이 있는지 확인하였다.

희석액만 접종한 샘플(음성대조군)에서 균의 증식이 발생한 경우 부적합하므로 24시간마다 증식이 발생하지 않는 것을 육안으로 확인하며 OD값을 측정하여 기록하였다. OD값은 spectrophotometer를 사용하여 600 nm에서 측정하였다. 아무것도 접종하지 않고 배양한 TSB로 blank를 설정한 후, 음성대조군, 양성대조군, 접종 검체의 값을 측정하였다.

- 액상티오글리콜산배지(Fluid Thioglycollate Medium, FTM)

FTM (MB-F1026P-T50, Lot No.: R3041074HM, MBcell, South Korea) 배지 10 mL에 국내 균주 S. aureus NCCP 11854, P. aeruginosa NCCP 15783와 국외 참조균주 S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 9027을 동일한 CFU 값을 측정(100 CFU 이하)하여 검체 대용인 생리식염수와 함께 접종하였다. 대상 균주가 세균이므로 30-35°C에서 세균은 3일 배양하였다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 다른 FTM 배지 10mL에 희석액만 접종하여 음성대조군으로 하였으며, 양성대조군으로 배지 적합성 시험을 하였다. 배지 적합성 시험과 측정법의 적합성 시험은 동시에 진행할 수 있다. 배지는 파우더를 증류수에 녹여 멸균 후 적절한 용기에 분주하였고 사용 전 배지의 연한 빨간색 부분이 위로부터 1/3 이상 연한 빨간색으로 변한 경우 1회에 한하여 연한 빨간색이 소실할 때까지 배지 용기를 수욕 또는 유통 증기에서 가열한 후 급속 냉각시켜 사용하였다.

각각의 균주를 접종한 샘플에서 24시간마다 증식한 성상을 사진으로 기록하였으며 3일 이내 육안으로 선명한 증식이 있는지 확인하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 발생하지 않는 것을 확인하며 24시간마다 사진으로 기록하였다.

3) 미생물한도시험법: 비무균제품의 미생물학적시험-생균수시험 유용성 분석(Microbiological Examination of Non-sterile Products, Microbial Test of Non-sterile Products: Viable Cell Count)

(1) 배지 무균시험(Sterility Test)

배지가 무균상태에서 생산되었고, 유통과 보관상에서도 오염되지 않은 상태임을 판단, 확인하기 위해 관찰하였다. 배양목적에 따라 제시된 온도에서 14일간 배양하여 오염 여부를 관찰하였고 요구되는 호기나 혐기 조건에서도 배양, 관찰하였다. 샘플은 무작위로 5개를 선택하여 20-25, 30-35°C에서 검사하였고 14일 후 미생물의 증식이 관찰되지 않으면 적합으로, 증식이 보이면 부적합으로 판정하였다.

(2) 배지 적합성 시험(Growth Promotion Test)

시험 대상 배지로 TSB(MB-T1053-P50, Lot No.: R3038151ME, KisanBio Co. MBcell, South Korea), TSA와 SD Agar를 사용하였고 해당 제품에 대한 국내 균주와 국외 참조 균주의 증식 및 억제 능력을 확인하여 배지의 적합성을 확인하였다. 배지에 국내 균주 및 국외 참조균주를 100 CFU 이하 접종 후 배양하여 증식을 확인하고, 배지가 포함하고 있는 영양성분에 따른 접종균의 증식 및 억제 여부를 관찰하였다. 액체배지의 경우 결과를 육안으로 식별하고 사진으로 기록하였으며, 고체배지의 경우 출현 집락수가 접종균 CFU의 1/2-2배 이내임을 확인하고 사진으로 기록하였다. 균은 5세대 이하의 계대 배양된 균주를 사용하였다.

배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 CFU를 확인하였다. TSA 와 SD Agar 배지의 적합성 시험에서 접종균의 CFU를 확인할 때는 배지 성능이 확인된 다른 lot의 TSA와 SD Agar 배지를 사용하였다. 사용되는 희석액은 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다. 현탁액은 일반적으로 2시간 이내에 사용하였으며, 2-8°C에 보관한 경우에는 24시간 이내에 사용하였다.

TSB 배지의 경우, 생균수 측정법으로 최적확수법(Most-probable number method, MPN)에만 사용되고 본 시험에서는 한천평판도말법만 진행하기에 배지 적합성 시험에만 포함하고 측정법의 적합성 시험에서는 본 배지 사용을 제외하였다.

(3) 측정법의 적합성 시험

- TSA 배지

검체가 있는 상태에서 균주의 성능을 비교하기 위해 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 실시하였다.

시험방법은 한천평판도말법으로 사용하며, 검체(생리식염수) 10배 희석액을 조제한 후 국내 균주와 국외 참조균주 각각 접종균 양이 100 CFU 이하가 되도록 충분한 양의 시험균 현탁액을 조제한 검액에 넣었다. 접종균은 S. aureus NCCP 11854, S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa NCCP 15783, P. aeruginosa ATCC 9027, C. albicans NCCP 31538, C. albicans ATCC 10231로 모두 계대배양 5세대 이내로 이용하며 이때 접종균 현탁액의 양은 검액량의 1%를 초과하지 않도록 한다. 양성대조군은 시험균 현탁액 각각을 대조액(희석액)에 접종하여 사용하며, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액을 사용한다. 균을 접종한 검액과 양성대조군 그리고 음성대조군 각각 0.1 mL씩을 TSA 배지에 2개씩 접종하였다.

세균은 30~35°C에서 3일 이내로, 진균은 30~35°C에서 5일 이내로 배양하였다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인한다. 배지 파우더를 멸균 후 적절한 용기에 분주하여 사용한다. 각각의 균주와 검체대용인 생리식염수를 접종한 디쉬와 희석액과 균주를 접종한 양성대조군 디쉬의 회수율을 비교하여 1/2~ 2배 이내인지 확인하고 사진으로 기록한다. 희석액만 접종한 샘플에서는 증식이 발생하지 않는 것을 확인하며 사진으로 기록하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

- SD Agar 배지

검체가 있는 상태에서 균주의 성능을 비교하기 위해 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 하였다. 우선 한천평판도말법으로 하여 희석액을 사용하여 검체로 이용하는 생리식염수 10배 희석액을 조제한 후 100 CFU 이하의 접종균을 얻는데 충분한 양의 시험균 현탁액을 국내 균주와 국외참조 균주 각각 조제한 검액에 넣었다. 접종에 이용한 균주는 계대 배양 5세대 이내의 C. albicans NCCP 31538, C. albicans ATCC 10231이며 모두 5세대 이내로 계대배양하여 이용하며 이때 접종균 현탁액의 양은 검액량의 1%를 초과하지 않도록 하였다.

양성대조군은 시험균 현탁액 각각을 대조액(희석액)에 접종하여 사용하며, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액을 사용하였다. 균을 접종한 검액과 양성대조군 그리고 음성대조군 각각 0.1 mL씩을 SD Agar 배지에 2개씩 접종 후 20~25°C에서 5일 이내로 배양하였다. SD Agar 배지는 파우더를 멸균 후 적절한 용기에 분주하여 사용한다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다.

각각의 균주와 검체 대용인 생리식염수를 접종한 디쉬와 희석액과 균주를 접종한 양성대조군 디쉬의 회수율을 비교하여 1/2~2배 이내인지 확인하고 사진으로 기록하고 희석액만 접종한 샘플에서는 증식이 발생하지 않는 것을 확인하며 사진으로 기록하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

4) 미생물한도시험: 비무균제품의 미생물학적시험-특정미생물 시험 유용성 분석(Microbiological Examination of Non-sterile Products, Microbiological Test of Non-sterile Products: Tests for specific microorganisms)

(1) 배지 무균시험(Sterility Test)

시험에 사용되는 배지가 무균상태에서 생산되었고 보관상에서도 오염되지 않은 상태임을 판단, 확인하기 위해 관찰하였다. 배양목적에 따라 제시된 온도에서 14일간 배양하여 오염 여부를 관찰하였고 요구되는 호기나 혐기 조건에서도 배양, 관찰하였다. 샘플 수는 무작위로 5개를 선택하여 20-25°C와 30-35°C에서 검사 하였고, 판정은 14일 후 미생물의 증식이 관찰되지 않으면 적합으로, 증식이 보이면 부적합으로 판정하였다.

(2) 배지 적합성 시험(Growth Promotion Test)

배지에 포함되어 있는 영양성분에 따른 접종균의 증식 및 억제 여부를 관찰하기 위해 해당 제품에 대한 국내 균주와 국외참조균주의 증식 및 억제 능력을 확인하여 배지의 적합성을 확인하였다. 이 시험을 위한 액체배지로 모젤장내세균증균액체배지(Enterobacteriaceae Enrichment, EE Broth, MB-E1017-B10, Lot No.: R3042181ME, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 맥콘키액체배지(MacConkey Broth, MB-M1337-B10, Lot No.: R3042044HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 라파포트바시리아디스액체배지(Rappaport-Vassiliadis, RV, MB-R1175P-T50, Lot No.: R2943051ME, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 사브로포도당액체배지(Sabouraud Dextrose, SD Broth, MB-S2248-B10, Lot No.: R3042045HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea)를 사용하였고, 고체배지는 바이올렛레드담즙산포도당한천배지(Violet Red Bile Glucose Agar, VRBG MB-V1059-P50, Lot No.: R3042042HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 맥콘키한천배지(MacConkey Agar(MB-M1028-P50, Lot No.: R3040161HM KisanBio Co. MBcell, South Korea), 엑스엘디한천배지(Xylose Lysine Desoxycholate, XLD Agar, MB-X1060PP50, Lot No.: R3042143HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 세트리미드한천배지(Cetrimide, CN Agar, MB-C2137-P50, Lot No.: R3040053HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 만니톨염화나트륨한천배지(Mannitol Salt Agar, MB-M1029P-P50, Lot No.: R3042043HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea), 사브로포도당한천배지(Sabouraud Dextrose, SD Agar, MB-S1527-P50, Lot No. R3041141HM, KisanBio Co. MBcell, South Korea)를 사용하였다.

증식촉진특성시험을 위해 액체배지의 경우, 적당한 배지의 일부에 균주를 100 CFU 이하로 소량 접종하여 규정된 온도에서 배양하였고, 배양시간은 시험법에서 규정된 배양시간 중 최단시간 이내로 하였다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인하고 사진으로 기록하였다.

증식촉진특성시험을 위해 고체배지의 경우, 각 평판배지에 균주를 100 CFU 이하로 소량 접종하고 한천평판도말법으로 시험하였다. 규정된 온도에서 배양하였고, 배양시간은 시험법에서 규정된 배양시간 중 최단시간 이내로 하였다. 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 증식과 동등한 증식을 확인하고 사진으로 기록하였다.

증식억제특성시험을 위해 일부 액체 및 고체배지에 균주를 100 CFU 정도 접종하여 규정된 온도에서 배양하였고 배양시간은 시험법에 규정된 배양시간 중 최장시간 이상으로 하였다. 시험균의 증식이 확인되지 않음을 확인하고 사진으로 기록하였다. 감별특성시험을 위해 각 평판배지에 균주를 100 CFU 이하로 소량 접종하고 한천평판도말법으로 시험하였다. 규정된 온도에서 배양하였고 배양시간은 시험법에 규정된 배양시간의 범위 내로 하였다. 집락의 형상과 감별반응은 유효성이 확인된 배지 배치에서 이전에 시험하여 얻은 것과 동등함을 확인하고 사진으로 기록하였다.

배지성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였고, SD Agar 배지의 적합성 시험에서 접종균의 CFU를 확인할 때는 배지 성능이 확인된 다른 lot의 SD Agar 배지를 사용하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였고, 현탁액은 일반적으로 2시간 이내에 사용하였으나, 2-8°C에 보관한 경우에는 24시간 이내에 사용하였다.

(3) 측정법의 적합성 시험

검체 존재 하에서 균주의 성능을 비교하기 위해 실시하며 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 하였다.

- 담즙산저항성 그람음성균

검체 대용인 생리식염수 1g (또는 mL) 이상을 취하여, 그 10배 희석액을 생균수 시험에 따라 조제하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다. TSB 파우더를 증류수에 녹여 멸균 후, 적절한 용기에 분주하여 섞은 다음 국내 균주와 국외 참조균주 각각 동일한 CFU 값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종하였고, 균을 소생시키기에는 충분하나 증균을 촉진하지 않는 적절한 시간(보통 2시간이며 5시간 이내) 동안 20-25°C에서 배양하였다. 접종 균주는 E. coli NCCP 12480, E. coli ATCC 8739, P. aeruginosa NCCP 15783, P. aeruginosa ATCC 9027을 모두 5세대 이내로 계대배양하여 사용하였다.

양성대조군으로는 검체 대신 희석액을 사용하여 국내 균주와 국외 참조균주 각각을 접종하였고, 음성대조군으로는 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다.

부정시험으로 전 배양한 각 시험관으로부터 검체 1g (또는 mL)에 해당하는 검액을 EE Broth 배지에 접종하여, 30~35°C에서 24~48시간 동안 배양한 다음 사진으로 기록하고, VRBG Agar 배지에 이식하여 30-35°C에서 18-24시간 동안 배양하였다. 이때 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고양성대조군, 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식이 있는 것을 확인하였다.

정량시험으로 전 배양한 조제액 또는 그 희석액으로 검체를 각각 0.1, 0.01, 0.001 g (또는 mL)의 적당량을 취해 EE Broth 배지에 접종한 뒤, 30-35°C에서 18-24시간 동안 배양한 다음 사진으로 기록하고 VRBG Agar 배지에 이식하여 30-35°C에서 18-24시간 동안 배양하였다. 이때 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고 양성대조군, 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식을 확인하였으며, 국내 균주 및 국외 참조균주에서의 추정수 결과를 비교하였다.⁷⁾

또한, 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다.

- 대장균, Escherichia coli

검체 대용인 생리식염수는 1g (또는 mL) 이상을 취하여 생균수 시험에 따라 제조한 10배 희석액 10mL 혹은 검체 1g (또는 mL)에 E. coli NCCP 12480과 E. coli ATCC 8739 각각을 동일한 CFU값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종 후 적당량의 TSB 배지에 넣어 섞은 다음, 30-35°C에서 18-24시간 배양하였다. 양성대조군은 희석액에 국내 균주와 국외참조 균주를 각각 접종하였으며, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다. 각 시험관으로부터 전 배양액 1mL을 MacConkey Broth 배지 100 mL에 접종하고 42-44°C에서 24-48시간 동안 배양하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고 양성대조군과 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식이 있는 것을 확인한 뒤 다시 사진으로 기록하였다.

MacConkey Agar 배지에 이식 후 30-35°C에서 18-72시간 배양한 뒤 다시 사진으로 기록하였다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

- 살모넬라균, Salmonella Typhimurium

검체가 있는 상태에서 균주의 성능을 비교하기 위해 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 수행하였다. 검체 10g (또는 mL) 또는 그 이상을 취하여, S. Typhimurium NCCP 16345와 S. Typhimurium ATCC 14028 각각을 동일한 CFU값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종 후 TSB배지에 넣어 섞은 다음, 30-35°C에서 18-24시간 배양하였다. 양성대조군은 희석액에 국내 균주와 국외 참조균주를 각각 접종하였고, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다. 각 시험관으로부터 전 배양액 0.1mL을 RV Broth 배지 10mL 에 접종하여 30-35°C에서 18-24시간 동안 배양하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고 양성대조군과 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서는 증식이 있는 것을 확인한 뒤 사진으로 기록하고 XLD Agar 배지에 이식하여 30-35°C에서 18-48시간 배양한 뒤 사진으로 기록하였다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

- 녹농균, Pseudomonas aeruginosa

검체 대용인 생리식염수를 1 g (mL) 이상 취하여 생균수 시험에 따라 제조한 10배 희석액 10 mL 혹은 검체 1 g (mL)에 해당하는 양에 P. aeruginosa NCCP 15783과 P. aeruginosa ATCC 9027 각각을 동일한 CFU값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종 후, 적당량의 TSB 배지에 넣어 섞은 다음 30-35°C에서 18-24시간 배양하였다. 양성대조군은 희석액에 국내 균주와 국외 참조균주를 각각 접종하였고, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고, 양성대조군과 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식이 있는 것을 확인한 뒤 사진으로 기록하였고, CN Agar 배지에 이식 후 30-35°C에서 18-72시간 배양한 뒤 다시 사진으로 기록하였다. 배지 성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였다. 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나, 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

- 황색포도상구균, Staphylococcus aureus

검체가 있는 상태에서 균주의 성능을 비교하기 위해 검체 대용으로 생리식염수를 사용하여 측정법의 적합성 시험을 수행하였다. 검체 대용인 생리식염수를 1 g (또는 mL) 이상 취하여 생균수 시험에 따라 제조한 10배 희석액 10mL 혹은 검체 1g (또는 mL)에 해당하는 양에 S. aureus NCCP 11854와 S. aureus ATCC 6538을 각각 동일한 CFU값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종 후 적당량의 TSB에 넣어 섞은 다음 30-35°C에서 18-24시간 배양하였다. 양성대조군은 희석액에 국내 균주와 국외 참조균주를 각각 접종하였고, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고, 양성대조군과 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식이 있는 것을 확인한 뒤 사진으로 기록하였고 Mannitol Salt Agar 배지에 이식하여 30-35°C에서 18-72시간 배양한 뒤 다시 사진으로 기록하였다.

배지성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였고 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

- 칸디다알비칸스, Candida albicans

검체 대용인 생리식염수를 1g (또는 mL) 이상 취하여 생균수 시험에 따라 제조한 10배 희석액 10mL 혹은 검체 1g (또는 mL)에 해당하는 양에 C. albicans NCCP 31538과 C. albicans ATCC 10231 각각을 동일한 CFU값을 측정하여(100 CFU 이하) 접종 후 적당량의 SD Broth 배지에 넣어 섞은 다음 30-35°C에서 3-5일 배양하였다. 양성대조군은 희석액에 국내 균주와 국외 참조균주를 각각 접종하였고, 음성대조군은 균을 넣지 않은 희석액만을 사용하였다. 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 없고, 양성대조군과 검체와 균주를 함께 접종한 시험관에서만 증식이 있는 것을 확인한 뒤 사진으로 기록하고, 이후 SD Agar 배지에 이식하여 30-35°C에서 24-48시간 배양한 뒤 다시 사진으로 기록하였다. 배지성능이 확인된 TSA 또는 SD Agar 배지에 균을 배양하여 접종균의 CFU를 확인하였고 희석액으로는 인산완충액(pH 7.2)이나 펩톤 염화나트륨 용액(pH 7.0)을 사용하였다.

1. 국내 후보균주와 참조균주의 동정 확인 및 분자생화학적 특성분석 결과

1) Staphylococcus aureus NCCP 11854 and Staphylococcus aureus ATCC 6538

(1) MALDI-TOF MS 분석 결과

국내 균주 NCCP 11854주의 score value는 2.31이고 ATCC 6538주의 score value는 2.12로 확인되었다.

(2) 16S rRNA 염기서열 분석 결과

국내 균주 NCCP 11854주는 ATCC 6538주와 99.73%의 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(3) VITEK-2 분석 결과

국내 균주 NCCP 11854는 95%로 ATCC 6538주는 99%로 확인되었다.

(4) MLST 분석 결과

국내 균주 NCCP 1 1854의 ST 값은 59이고 참조균주 ATCC 6538주의 ST 값은 464로 확인되었다.

(5) 독소 유전자 분석 결과

독소형 TST, EXT-A, EXT-B, SET-A, SET-B, SET-C, SET-D에 대한 응집 반응 여부를 확인한 결과 NCCP 11854주와 ATCC 6538주는 는 모두 음성으로 확인 되었다.

(6) 혈청형 유전자 분석 결과

S. aureus의 coagulase 유전자를 증폭하여 분석한 결과 NCCP주는 850 bp 크기로, ATCC주는 900 bp 크기로 증폭 되었고, 이 산물을 제한효소를(Nde I)를 이용하여 RFLP 분석한 결과 DNA 절편 패턴은 80-170-330 bp로 동일하게 확인되었다.

(7) 디스크확산법 이용 항생제 감수성 분석 결과

분석에 사용된 베타락탐계 및 페니실린계 항생제는 penicillin, tetracycline, ciprofloxacin, erythromycin, oxacillin, cefoxitin이며, 국내 균주 NCCP 11854는 penicillin에서만 내성이고 다른 항생제에는 감수성이 있는 것으로 확인되었고 참조균주 ATCC 6538 주는 모든 항생제에 감수성이 있는 것으로 확인되었다.

2) Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

(1) MALDI-TOF MS 분석 결과

국내 균주 NCCP 15783주의 score value는 2.23이고, ATCC 9027주의 score value는 2.45로 확인되었다.

(2) 16s rRNA 염기서열 분석 결과

국내 균주 NCCP 15783주는 ATCC 9027주와 99.93%의 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(3) VITEK-2 분석 결과

국내 균주 NCCP 15783주는 97%로, ATCC 9027 주는 98%로 확인되었다.

(4) MLST 분석 결과

국내 균주 NCCP 15783주의 ST 값은 277이고 참조균주 ATCC 9027주의 ST 값은 2230로 확인되어 일치하지 않았다.

(5) 독소 유전자 분석 결과

독소 유전자 5종(toxA, exoS, exoT, exoU, exoY)에 대한 분석결과 NCCP 15783주는 toxA, exoS와 exoT는 양성으로 exoU와 exoY는 음성으로 확인되었다. ATCC 9027주는 독소유전자가 없는 비병원성으로 확인되었다.

(6) 항생제감수성 분석 시험 결과

분석에 사용된 카바페냄 및 세팔로스포린계 항생제는 cefepime, gentamicin, imipenem, tobramycin, piper/tazo, ceftazidime이며, 국내 균주 NCCP 15783과 참조균주 9027주는 모든 항생제에 감수성이 있는 것으로 확인되었다.

3) Escherichia coli NCCP 12480 and Escherichia coli ATCC 8739

(1) MALDI-TOF MS 분석 결과

국내 균주 NCCP 12480주의 score value는 2.18이고, ATCC 8739주의 score value는 2.10으로 확인되었다.

(2) 16S rRNA 염기서열 분석 결과

국내 균주 NCCP 12480주는 ATCC 8739주와 98.9%의 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(3) VITEK-2 분석 결과

국내 균주 NCCP 12480주와 ATCC 8739주는 모두 99%로 확인되었다.

(4) MLST 분석 결과

국내 균주 NCCP 12480주의 ST 값은 93이고 참조균주 ATCC 8739 주의 ST 값은 3021로 확인되었다.

(5) 독소 유전자 분석 결과

국내 균주 NCCP 12480주와 ATCC 8739주는 모두 독소 유전자를 가지지 않는 비병원성으로 확인되었다.

(6) 특이항원 등 혈청형 유전자 분석 결과

sero-grouping과 serotying 실험 결과, NCCP 12480주와 ATCC 8739주 모두 혈청 그룹은 B형, O 혈청형은 O15형으로 확인되었다.

(7) 항생제 감수성 분석 결과

9개 계열 15개 항생제(AMP, AMC, FOX, CAZ, FEP, ETP, IPM, MEM, DOR, GEN, TET, CIP, NAL, TMP/SMX, CHL) 에 대해 Sensititre KRNV5F 패널과 KORN패널을 사용한 결과, NCCP 12480주와 ATCC 8739주는 모든 항생제에 대해 감수성이 있는 것으로 확인되었다.

4) Salmonella Typhimurium NCCP 16345 and Salmonella Typhimurium ATCC 14028

(1) MALDI-TOF MS 분석 결과

국내 균주 NCCP 16345주의 score value는 2.24, ATCC 14028주의 score value는 2.42로 확인되었다.

(2) 16S rRNA 염기서열 분석 결과

국내 균주 NCCP 16345주는 ATCC 14028주와 99.8%의 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(3) VITEK-2 분석 결과

국내 균주 NCCP 16345주와 ATCC 14028주는 모두 97%이상의 Salmonella ser. Typhimurium 등이 포함된 속 그룹으로 확인되었다.

(4) MLST 분석 결과

국내 균주 NCCP 16345주와 ATCC 14028주의 ST 값은 모두 19로 일치하는 것으로 확인되었다.

(5) 혈청형 확인시험 결과

항혈청과 항원에 대한 응집 반응결과 NCCP 16345주와 ATCC 14028주의 혈청형은 모두 4,12:i1,2의 Typhimurium으로 확인되었다.

(6) 항생제 감수성 분석 결과

11개 계열 18개 항생제 (AMP, PIP, AMC, FEP, FOX, FOT, TAZ, TMP/SMX, CHL, CIP, NAL, GEN, TET, ETP, IMI, MERO, DOR, AZT)에 대해 Sensititre KRNV5F 패널과 KORN 패널, ARMGN1패널을 사용하여 NCCP 16345주와 ATCC 14028 주에 적용한 결과, NCCP 16345주의 경우 항생제 NAL, TET에 대하여 내성을 가지는 것으로 확인되었고, ATCC 14028주의 경우 모든 항생제에 대하여 감수성을 갖는 것으로 확인되었다.

5) Candida albicans NCCP 31538 and Candida albicans ATCC 10231

(1) MALDI-TOF MS 분석 결과

국내 균주 NCCP 31538주의 score value는 2.07, ATCC 10231주의 score value는 2.38로 확인되었다.

(2) 16S rRNA 및 ITS 염기서열 분석 결과

국내 균주 NCCP 31538주는 ATCC 10231주와 99.4%의 높은 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

(3) MLST 분석 결과

국내 균주 NCCP 31538주의 ST 값은 304이고 ATCC 10231주의 ST 값은 402로 확인되었다.

(4) 항진균제 최소억제 농도 시험 결과

3개 계열(Azole계, Polyene계, Echinocandin계)의 9개 항진균제 (amphotericin B, flucytosine, itraconazole, fluconazole, voriconazole, posaconazole, anidulafungin, micafungin, caspofungi)에 대해 NCCP 31538주와 ATCC 10231주 모두 감수성이 있는 것으로 확인되었다.

2. 국내 대체 후보균주에 대한 동등성 분석(Equivalence analysis of Microbiological Methods using Five NCCP Strains)

1) 시험균 희석배수 확인 결과

본 시험에 사용되는 각 종별 국내 균주(NCCP)와 국외 참조균주(ATCC)를 단계 희석하여 배양한 결과 모두 100 CFU 이하로 확인되었으며, 각 종별로 적정 희석배수를 확인 하였다(Table 15, Fig. 1).

Fig. 1. Dilution test and viable count of five NCCP and ATCC strains used in microbial test (less than 100 CFU), (A) and (B), Candida albicans NCCP 31538; (C) and (D), Candida albicans ATCC 10231; (E) and (F), Escherichia coli NCCP 12480; (G) and (H), Escherichia coli ATCC 8739; (I) and (J), Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783; (K) and (L), Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; (M) and (N), Salmonella Typhimurium NCCP 16345; (O) and (P), Salmonella Typhimurium ATCC 14028; (Q) and (R), Staphylococcus aureus NCCP 11854; (S) and (T), Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Table 15

Dilution and viable count for five Korean strains (NCCP) and five reference strains (ATCC)

Species	Strains	Growth CFU(1/2)	Dilution factor	Culture Condition (Tm./hr.)
Candida albicans	NCCP 31538	46/56	4×103	20~25°C/72
	ATCC 10231	56/67	4×103	20~25°C/72
Escherichia coli	NCCP 12480	63/57	2×105	30~35°C/48
	ATCC 8739	69/62	2×105	30~35°C/48
Pseudomonas aeruginosa	NCCP 15783	40/44	3×105	30~35°C/48
	ATCC 9027	57/63	3×105	30~35°C/48
Salmonella Typhimurium	NCCP 16345	55/59	2×105	30~35°C/48
	ATCC 14028	41/56	2×105	30~35°C/48
Staphylococcus aureus	NCCP 11854	78/49	2×105	30~35°C/48
	ATCC 6538	66/74	2×105	30~35°C/48

2) 무균시험 유용성 분석 결과

(1) 배지 무균시험 결과

연구에 사용된 TSB와 FTM 배지가 무균상태로 적합함을 확인하였다.

(2) 배지 적합성 시험 및 측정법 적합성 시험 결과

TSB 배지에는 C. albicans를, FTM 배지에는 S. aureus와 P. aeruginosa를 각각 100 CFU 이하로 접종하여 각 배양 기간 내에 증식됨을 O.D값을 측정하여 확인하였다(Fig. 2, Fig. 3). 접종한 각 균의 콜로니 형상과 CFU가 정상 범위 안에 존재하고 배지의 증식도 정상으로 확인되었으며, 국내 균주와 국외 참조균주의 결과에 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 또한, 검체와 비교하여 양성대조와 동등하게 증식되는 것을 육안으로 확인하였다(Table 16).

Fig. 2. Inoculation CFU of Candida albicans NCCP 31538 and ATCC 10231 used suitability test in TSB media.

Fig. 3. Inoculation CFU of Staphylococcus aureus NCCP 11854 and ATCC 6538, and Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783 and ATCC 9027 used suitability test in FTM media.

Table 16

Growth of C. albicans NCCP 31538 and ATCC 10231 in TSB (OD 5 days)

Inoculation and samples			Day
Strains	CFU	Substance	1	2	3	4	5
Negative control (Saline)	-	1	0	0	0	0	0
	-	2	0	0	0	0	0
Candida albicans NCCP 31538	52.5	positive control 1	0.002	0.471	0.883	1.089	1.182
		positive control 1	0	0.373	0.933	1.902	1.165
		sample 1	0	0.383	0.82	0.95	1.178
		sample 2	0	0.419	0.86	0.798	1.169
Candida albicans ATCC 10231	62	positive control 1	0	0.216	0.812	0.891	1.074
		positive control 1	0.002	0.253	0.622	0.714	1.037
		sample 1	0.001	0.345	0.657	0.924	0.989
		sample 2	0	0.352	0.692	0.834	0.983

3) 미생물한도시험: 생균수시험 유용성 분석 결과

- 배지 무균시험 및 배지 적합성 시험

배지 무균시험을 위해서 TSB 배지, TSA 배지와 SD Agar 배지를 사용하여 무작위로 샘플 5개를 접종한 후 14일간 배양한 결과 미생물 증식이 관찰되지 않아 무균상태임을 확인하였다. 이 가운데 TSB 배지에 대해서는 100 CFU 이하의 S. aureus 종과 P. aeruginosa종의 국내 균주와 국외 참조균주를 접종한 후 육안으로 배지가 적합함을 확인하였다. 또한 TSA 배지에는 S. aureus, P. aeruginosa와 C. albicans 3종을, SD Agar 배지에는 C. albicans 종의 국내 균주와 국외 참조균주를 100 CFU 이하로 접종하여 증식을 확인한 결과, 접종균의 1/2-2배의 CFU가 증식되어 배지가 적합함을 확인하였다(Fig. 4~6).

Fig. 4. Inoculation CFU and growth result of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa for suitability test in TSB media (A and B, S. aureus; C and D, P. aeruginosa.)

Fig. 5. Inoculation CFU and growth result of Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans for suitability test in TSA media (A and B, S. aureus; C and D, P. aeruginosa; E and F, C. albicans, less than 100 CFU).

Fig. 6. Inoculation CFU and growth result of Candida albicans for suitability test in SD agar media (A and B, C. albicans, less than 100 CFU).

- 측정법의 적합성 시험(한천평판도말법)

배지 성능이 확인된 TSA 배지에 접종된 검체(생리식염수)와 3종의 국내 균주와 국외 참조균주(S. aureus NCCP 11854, S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa NCCP 15783, P. aeruginosa ATCC 9027, C. albicans NCCP 31538, C. albicans ATCC 10231)의 배양 증식 결과, 음성대조군에서는 증식이 되지 않고 양성대조군에서는 회수율이 1/2-2배로 증식됨을 확인하였다. 또한, 배지 성능이 확인된 SD 배지에 접종된 검체와 C. albicans NCCP 31538주와 C. albicans ATCC 10231주의 희석액만 접종한 음성대조군에서는 증식이 되지 않고 균종별 양성대조군에서는 회수율이 1/2-2배로 증식됨을 확인하였다(Fig. 7, 8).

Fig. 7. Inoculation CFU of three species and growth results for suitability of the test method in TSA media (Culture, bacteria: 30~35°C, 24 h; fungi: 20~25°C, 3d; comparing negative control using PBS and samples after culture; A and B, Staphylococcus aureus; C and D, Pseudomonas aeruginosa; E and F, Candida albicans).

Fig. 8. Inoculation average CFU of Candida albicans and growth results for suitability of the test method in SD agar media (comparing negative control using PBS and samples).

4) 미생물한도시험: 특정미생물시험 유용성 분석 결과

- 배지 무균시험 및 배지 적합성 시험

10개의 대상 배지 별로 미생물이 자라지 않고 무균상태로 유지됨을 육안으로 확인하였다. 또한 접종한 균의 CFU가 정상 범위 안에 존재하고, 특정 미생물에 대한 배지의 증식과 억제가 정상으로 확인되었으며, 국내 균주와 국외 참조균주의 결과에 유의한 차이가 없음을 확인하였다(Supplemental 1; Fig. 9).

Fig. 9. Result of test for growth promoting and inhibitory properties of the media, suitability of the test method for NCCP and ATCC strains of five species.
(A) Inoculation CFU of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in EE media and indicative properties in VRBG and TSA media (below); (B) Inoculation CFU of E. coli, and P. aeruginosa (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in VRBG agar media (below); (C) Inoculation CFU of E. coli, and S. aureus (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in MacConkey broth media (below); (D) Inoculation CFU of E. coli (upper) and result of growth promoting properties for species in MacConkey agar media (below); (E) Inoculation CFU of Salmonella Typhimurium, and S. aureus (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in RV broth media and indicative properties in XLD media (below); (F) Inoculation CFU of S. Typhimurium (upper) and result of growth promoting properties for species in XLD Agar media (below); (G) Inoculation CFU of P. aeruginosa, and E. coli (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in CN agar media (below); (H) Inoculation CFU of S. aureus, and E. coli (upper) and result of growth promoting and inhibitory properties for each species in Mannitol Salt agar media (below); (I) Inoculation CFU of C. albicans (upper) and result of growth promoting properties for species in SD broth media (below); (J) Inoculation CFU of C. albicans (upper) and result of growth promoting properties for species in SD agar media (below).

- 측정법의 적합성 시험(한천평판도말법)

검체를 이용하여 부정시험을 실시한 결과 담즙산저항성 그람 음성균인 E coli와 P. aeruginosa종의 국내 균주와 국외 참조균주의 균 성장이 동등하고 모두 VRBG agar 배지로 이식 배양한 이후에도 집락증식이 없는 것으로 확인되었고, 정량시험을 실시한 결과에서도 유사한 희석배수에서 유사한 증식 양상을 보였다(Fig 10, 11). 또한, 각 종별로 1차 배양 후 이식 선택 배양한 후 검체와 시험군들의 집락 증식을 확인한 결과 모두 적합한 것으로 판정되었고, 국내 균주와 국외 참조균주 5종에 대한 비교분석 결과에 유의한 차이가 없음이 확인되었다(Supplemental 2: Fig. 12~16).

Fig. 10. Suitability of the test method for bile-tolerant gram-negative bacteria. (A) Inoculation CFU of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa; (B) growth findings for selective culture in VRBG agar media after culture in EE media with TBS diluent and saline solution for absence test.

Fig. 11. Suitability of the test method for bile-tolerant gram-negative bacteria.
(A) Inoculation CFU of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa; (B) growth finding for selective culture in VRBG agar media after culture in EE media with TBS diluent and saline solution (0.1 g (mL), 0.01 g (mL), 0.001 g (mL)) for quantitative test.

Fig. 12. Result of Suitability of the test method (surface-spread method) for Escherichia coli NCCP 12480 and ATCC 8739.

Fig. 13. Result of Suitability of the test method (surface-spread method) for Salmonella Typhimurium NCCP 16345 and ATCC 14028.

Fig. 14. Result of Suitability of the test method (surface-spread method) for Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783 and ATCC 9027.

Fig. 15. Result of Suitability of the test method (surface-spread method) for Staphylococcus aureus NCCP 11854 and ATCC 6538.

Fig. 16. Result of Suitability of the test method (surface-spread method) for Candida albicans NCCP 31538 and ATCC 10231.

대한민국약전은 1958년 최초 제정 이후, 5년마다 전면 또는 연 2회 일부 개정을 실시하여 지난 2019년 9월 제12차 개정판이 나왔고, 2023년과 2024년에 일부 개정되었다.¹⁾ 대한민국약전은 제정 및 개정 시 여러 국제약전들을 참고했었고, 미생물 시험균주를 참조균주로 사용하는 무균시험법, 미생물한도시험법, 항생물질의 미생물학적 역가시험법, 보존력시험법, 엔도톡신시험법은 대한민국약전, 유럽약전, 미국약전에 모두 기재되어 있다.

그러나 국내 제약업체들이 개발한 의약품에 대해 품질관리와 유효성 분석하고 의약품을 수출하기 위해서는 미국, 유럽 등 선진국의 국제약전에 담겨있는 미생물 시험법을 근거로 해야 하기에, 해당약전에서 시험균주로 사용하는 국외 참조균주(ATCC)의 확보가 매우 중요하다. 또한, 마이코플라즈마 부정시험법, 정제수 시험법, 미생물 신속동정 시험법은 미국약전과 유럽약전에만 요구하는 사항이기 때문에 제약회사들이 주사제 등 의약품 종류에 따라 국제 약전의 미생물시험법을 반드시 적용하여야 하는 경우도 있다.²⁾

본 연구에서는 국내 제약업체 및 보건의료 관련 기관들의 국외 참조균주에 대한 높은 수입 의존도와 경제적 비용 부담 등의 어려움을 줄이기 위해 의약품들 중 제형별로 가장 많이 요구되는 미생물시험법 가운에 무균시험법과 미생물한도시험법에서 시험균주로 사용되는 국외 참조균주(ATCC)를 국내 균주(NCCP)로 대체하기 위해 두 균주들의 특성 분석과 동등성 분석을 실시하였다. 그 결과 분자생물학적으로 두 균주의 상동성이 높았고 그 성능 역시 모두 정상 오차 범위 안의 반응으로 나타나 국내 균주 Staphylococcus aureus NCCP 11854, Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783, Escherichia. coli NCCP 12480, Salmonella Typhimurium NCCP 16345, Candida albicans NCCP 31538는 각각 국외 참조균주 S. aureus ATCC 6538, P. aeruginosa ATCC 9027, E. coli ATCC 8739, S. Typhimurium ATCC 14028, C. albicans ATCC 10231를 대체하여 사용해도 적합할 것으로 나타났다.

무균시험에서는 무균이 요구되는 원료와 제제에 적용하기 위해 배지 성능 시험과 측정법의 적합성 시험에 적절한 시험용 참조균주를 대체하는 비교실험을 수행하였고, 그 결과 미생물이 자라지 않는 무균상태로 유지되고 접종한 각 균의 콜로니 형상과 CFU가 정상 범위 안에 존재하며, 배지의 증식이 정상으로 확인되어 국내 균주와 국외 참조균주의 결과에 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다. 또한 검체 포함 시험군의 균 성장이 양성대조군과 동등하고 명확한 증식을 보여 이 결과도 각 균주에 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 미생물한도시험법 생균수 시험의 배지 무균시험에서는 미생물이 자라지 않고 무균상태로 유지됨을 확인하였고 배지 적합성시험에서도 접종한 각 균의 콜로니 형상과 CFU가 정상 범위 안에 존재하고, 배지의 증식이 정상으로 확인되었으며, 국내 균주와 국외 참조균주의 결과에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. 측정법의 적합성 시험에서는 검체 포함 시험군의 균 성장이 양성대조군과 동등하고 명확한 증식을 보여 이 결과도 유의한 차이가 없음이 확인되었다. 미생물한도시험법 특정미생물시험의 배지 무균시험에서도 미생물이 자라지 않고 무균상태로 유지됨을 확인하였고 배지 적합성 시험에서 접종한 균의 CFU가 정상 범위 안에 존재하고, 특정 미생물에 대한 배지의 증식과 억제가 정상으로 확인되었으며, 국내 균주와 국외 참조균주의 결과에 유의한 차이가 없음이 확인되었다. 측정법의 적합성 시험에서는 검체 포함 시험군의 균 성장이 양성대조군과 동등하고 명확한 증식을 보여 이 결과도 유의한 차이가 없음을 확인하였다.

결론적으로 본 연구를 통해 확인된 국내 균주 5종 5주, Pseudomonas aeruginosa NCCP 15783, Escherichia. coli NCCP 12480, Salmonella Typhimurium NCCP 16345, Candida albicans NCCP 31538는 대한민국약전에 기재된 국외 참조균주와의 동등성 시험 결과가 모두 정상 오차 범위 안에 반응하는 것으로 확인되어 약전 내 의약품 제조 및 품질관리 미생물시험 시 이 균주들을 대체 또는 병행으로 사용해도 적합한 것으로 판단된다.

향후, 국내에서 분리된 다양한 특성을 보유한 고품질 균주들이 표준 시험균주들로 국산화되어 식·의약품, 화장품 등의 제품개발 시 품질관리에 활용됨으로써 국외 균주 수입 등에서 발생하는 경제적 부담이 완화되고 자원을 이용하는 연구자들에게 편의성을 제공하게 될 것이며 국가병원체자원은행은 병원체자원 책임기관으로서 국가 경쟁력도 강화 될 것으로 기대한다.

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Su Yeon Kim : Research Officer

Ye Won Ahn : Researcher

Jun Ki Kim : Researcher

Ji Hee Lee : Researcher

Young Sil Choi : Researcher