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Synthesis of Effective Compounds and Evaluation of Anticancer Activity for Overcoming Gefitinib Resistance in Non-Small Cell Lung Cancer
Yakhak Hoeji 2024;68(2):94-97
Published online April 30, 2024
© 2024 The Pharmaceutical Society of Korea.

Kwang Il Kim*,†, So-Yeon Park**,†, Daeock Choi*,#, and Hangun Kim**,#

*Department of Chemistry, Sunchon National University
**Department of Pharmacy, Sunchon National University
Correspondence to: #Hangun Kim, College of Pharmacy, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si,, Jeollanam-do, Republic of Korea
Tel: +82-61-750-3761
Fax: +82-61-750-3708
E-mail: hangunkim@sunchon.ac.kr
#Daeock Choi, Department of chemistry, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si,, Jeollanam-do, Republic of Korea
Tel: +82-61-750-3634
Fax: +82-61-750-3630
E-mail: choido@scnu.ac.kr
These authors contributed equally to this work.
Received February 7, 2024; Revised March 10, 2024; Accepted March 31, 2024.
Abstract
Lung cancer remains a leading cause of global cancer-related mortality, emphasizing the need for innovative strategies to combat resistance to the first-generation EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs), Gefitinib. This study aimed to discover and evaluate small molecule compounds selectively inhibiting Gefitinib resistance. A compound library was screened against adenocarcinoma (A549), EGFR-mutant NSCLC (H1975 and PC9), and Gefitinib-resistant NSCLC (PC9GR) cell lines. The study identified W1 as a promising lead compound, and its derivative, compound W3, exhibited excellent efficacy in PC9 and PC9GR cells. These findings underscore the potential of W3, an 4-anilinopyrimidine derivative, as an inhibitor of Gefitinib resistance in NSCLC. This research contributes valuable insights to the ongoing efforts in developing effective and sustainable treatment options for lung cancer patients facing EGFR-TKI resistance.
Keywords : Lung cancer, NSCLC, EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-mutant
서 론(Introduction)

전 세계적으로 암 발병과 사망률이 증가하고 있으며, 폐암은 가장 흔한 암 중 하나로, 전체 암 사례의 11.6%를 차지하며 암사망의 주요 원인 중 하나이다.1) 특히 전체 암 사망 의 18.4%가 폐암으로 인한 것으로, 사회적 부담과 경제적 손실을 초래하고 있다. 폐암은 80~85%의 발생율을 차지하는 비소세포폐암(NSCLC)과 나머지 15% 발생률을 차지하는 소세포폐암(SCLC)로 분류한다.2) 비소세포폐암은 선암(LUAD), 편평상피세포암(LUSC), 대세포암(LCC)으로 세분화된다. 비소세포폐암의 발생과 진행에 영향을 미치는 분자생물학적 기전이 밝혀지면서, 이를 기반으로 다양한 진단 방법과 표적 치료제들이 개발되었다. 대표적으로 EGFR, RAS/RAF/MEK/MAPK/, PI3K/AKT/mTOR, ROS1, MET, RET, 등이 있고 이러한 핵심 종양유전자를 표적으로 하는 치료제가 암세포를 선택적으로 제거할 수 있다.3) EGFR 관련하여 EGFR-TKI는 EGFR 티로신키나아제 활성을 억제함으로써 (PI3K)/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPK, JAK/STAT 신호전달경로를 차단하고 따라서 암세포의 성장을 억제할 수 있다.4) 특히, EGFR 돌연변이는 아시아 환자에서 높은 검출률을 보이며, L858R 및 엑손 19 결실과 같은 전형적인 EGFR 돌연변이는 gefitinib에 민감성을 나타낸다.5) Gefitinib은 제1세대 EGFR-TKI로서, EGFR 도메인의 ATP 결합 포켓에 경쟁적으로 결합하여 하류 증식 신호전달을 차단하여 항종양 활성을 나타낸다.6) 그러나 gefitinib 치료 후 약 9~10개월 후에는 후천성 gefitinib 저항성(GR:gefitinib resistance)이 흔하게 발생한다.7,8) NSCLC에서의 주요 GR 메커니즘은 EGFR T790M 돌연변이로, 이에 대응하기 위해 osimertinib과 같은 제3세대 EGFR-TKI가 개발되었다.9,10) 그러나 osimertinib 치료 후 약 11개월 이후에도 후천성 내성이 여전히 발생한다. T790M 돌연변이 외에도 다양한 메커니즘의 후천성 GR이 보고되었다.11,12)

폐암에서의 T KI 치료제는 EGFR 돌연변이와 내성 메커니즘의 이해를 토대로 발전하고 있다. 현재까지 개발된 다양한 세대의 T KI는 초기 치료에서 효과를 나타내지만, 후천성 내성 문제는 여전히 중요한 과제로 남아 있다.13) 본 연구에서는 화합물 라이브러리를 이용하여 1세대 EGFR-TKI에 대해서 내성을 보이는 비소세포폐암 세포주를 선택적으로 저해할 수 있는 저분자 유효물질을 발굴하고자 하였다.

고전적인 신약개발을 살펴보면, 실험실적으로 축적된 경험에 따라 화합물을 합성한 후 논리적 추리를 통하여 화합물의 구조와 활성의 관계를 분석하여 새로운 형태의 분자를 고안하는 방식이다. 이에 반해 현재 각국의 여러 제약회사에서 진행하는 방식은 컴퓨터 기반의 신약설계(CADD: computer aided drug design)이다.14) 조합화학(combinatorial chemistry)을 통하여 신 물질을 대량 합성한 후 이를 in silico 방법인 가상검색(virtual screening)을 이용하여 약물의 흡수 및 대사를 삼차원 그래픽 및 계산화학적인 방법으로 예측하고 있다.15) 이러한 새로운 기술을 이용하여 효율적이고 저렴하게 신약개발을 위한 연구가 활발히 진행 중이지만, 의약화학 분야에서 고전적인 방법은 여전히 중요한 자리를 차지하고 있다. Molecular hybridization으로 불리는 설계전략은 두 개 이상의 알려진 생리활성 물질의 분자 구조에서 약리작용 성분의 조합에 기초하여 새로운 약물을 설계하고 개발하는 개념이다.16,17,18) 이를 통해 모약물의 기존 특성대비 개선된 선택성, 서로 다른 또는 이중 작용 모드 및 부작용을 감소시키는 hybrid compound를 얻을 수 있다.

본 연구의 목적은 이러한 접근법을 모방하여 이미 허가된 의약품의 생리활성을 띄는 구조들을 파악한 후 이들을 서로 결합시켜 새로운 항암물질을 개발하고자 하였다.

방 법(Methods)

화합물

본 연구에서 사용한 12종의 화합물은 순천대학교 화학과 유기화학실험실에 화합물 라이브러리로서 구축된 것을 사용하였다. 각각의 화합물들은 10mM 농도로 DMSO 용매에 녹여 4°C에서 보관 및 관리되고 있다.

세포배양

본 연구에서 사용한 인체 폐암세포주는 H1975, A549, PC9, gefitinib에 내성을 지닌 PC9이며 10% FBS (fetal bovine serum), streptomycin (500 mg/mL)과 penicillin (100 units/mL)을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 5% CO2와 37°C 조건하에 배양하였다.

세포생존율 측정

세포생존율의 측정은 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 사용하였다. H1975 (5×103 cells/well), A549 (1×104 cells/well), PC9 (5×103 cells/well), PC9GR (5×103 cells/well) 세포를 96 well plate에 각각 분주한 후 37°C와 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 화합물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 48시간 이후 MTT reagent를 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 뒤, 배지를 제거하고 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 well당 100 μL씩 분주하여 formazan 결정을 용해시킨 뒤, Biotek Eon microplate reader와 Gen5 (2.03.1) software (BioTek, Winsooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. IC50 값은 세포 생존율을 50% 감소시키는 데 필요한 화합물의 농도로 정의되며, SPSS, 버전 17 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

본 연구에 사용한 4-anilinopyrimidine 유도체(W1-W12)의 3단계 합성법은 Scheme 1과 같다. 세 가지 종류의 aniline 유도체(중간체 1)에 imidazole기를 먼저 도입한 후, 4,6-dichloro-2-methylpyrimidine과 친핵성 방향족 치환반응을 진행하여 중간체 (3a-3c)를 얻었다. 여기에 네 가지 종류의 piperazine 유도체와 친핵성 치환반응을 통해 최종 유도체 4(W1-W12) 합성을 완료하였다.



Fig. 1. Synthesis of 4-anilinopyrimidine derivatives W1-W12.

합성한 유도체의 항암 활성을 평가하기 위해서 A549, H1975, PC9, PC9GR 세포에 화합물을 처리하여 세포 생존율을 측정하였다. A549세포는 adenocacinoma로 KRAS mutation이며, H1975와 PC9 세포는 NSCLC로 EGFR mutation이다.19) 양성 대조약물로 sorafenib, imatinib, poziotinib, dasatinib, nilotinib을 사용하였다. 항암제들의 대표적인 작용기전은 sorafenib은 신장 세포암(RCC) 치료제로 VEGF와 PDGF tyrosine kinase의 활성을 억제하여 신생혈관 형성을 막고 암세포 증식을 억제한다. Imatinib은 1세대 만성 골수성 백혈병(CML) 치료제로 BCR-ABL tyrosine kinase를 억제하여 암세포의 증식, 분화 및 생존에 필요한 신호전달을 차단한다. Nilotinib은 2세대 BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor로 imatinib에 불응성인 CML환자에게 사용된다. Dasatinib은 CML 치료제로 ABL tyrosine kinase, Src tyrosine kinase에 작용하여 암세포의 성장과 생존 및 암전이를 억제한다. Poziotinib은 EGFR, HER tyrosine kinase inhibitor로 개발되어 위암, 간암, 폐암을 비롯해 EGFR, HER 변이를 갖는 암세포의 항암효과를 보인다.20)

세포생존율 측정 결과, imatinib과 nilotinib이 4개의 폐암세포주에서 높은 IC50값을 나타내며 생존율 저해 효능이 낮았음을 확인하였다. 반면, EGFR, HER tyrosine kinase inhibitor인 poziotinib은 H1975, PC9, PC9GR에서 낮은 IC50값을 나타내며 우수한 생존율 저해 효능을 보였다. 또한, dasatinib과 nilotinib의 molecular hybridization을 통해 합성된 화합물 W1은 PC9에서 선택적으로 억제 효과를 나타내었으며 PC9GR에서도 sorafenib, imatinib, poziotinib, dasatinib, nilotinib보다 낮은 IC50값을 보였다(Table 1).

IC50 values of the TKIs and W1 compounds against A549, H1975, PC9 and PC9GR cells for 48 h
Compounds IC50 (μM)a
A549 H1975 PC9 PC9GR
Sorafenib >27 >30 21±1.6 27.2±1.69
Imatinib >30 >30 >30 >30
Poziotinib >30 12±2.5 8.0±2.3 25.6±1.4
Dasatinib >30 >30 18.7±2.1 26.8±5.20
Nilotinib >30 >30 >30 >30
W1 >30 >30 8.6±4.8 22.3±1.5

aThe inhibitory activities of compounds were measured using the MTT assay. The data is shown by Mean±SD of 3 independent experiments.



W1을 포함한 총 12종의 화합물을 이용하여 PC9 및 PC9GR에서 세포생존율을 측정한 결과, W1, W2, W3, W5, W7에서 PC9의 세포 생존을 억제하는 효과가 나타났으며, 특히 W3은 가장 낮은 IC50값을 나타내며 우수한 세포 생존 억제 효과를 보였다. Gefitinib에 내성을 지닌 PC9GR세포에서도 W1, W2, W3, W7의 화합물이 세포성장 억제 효과를 나타냈으며 특히, W3화합물이 poziotinib보다 억제 효과가 우수하게 나타났다(Table 2). 본 연구결과를 토대로 12가지 화합물 중에서 W3이 PC9, PC9GR에서 가장 뛰어난 효능을 보임을 확인할 수 있었다.

IC50 values of the TKIs and W1 - W12 compounds against PC9 and PC9GR cells for 48 h
Compounds IC50 (μM)a
PC9 PC9GR
Poziotinib 8.0±2.3 25.6±1.4
W1 8.6±4.8 22.3±1.5
W2 10.7±5.5 27.4±1.7
W3 3.3±0.2 17.9±3.4
W4 26.3±0.1 >30
W5 10.4±2.2 >30
W6 21.2±1.1 >30
W7 12.3±2.8 24.4±4.8
W8 20.7±1.5 >30
W9 >30 >30
W10 >30 >30
W11 >30 >30
W12 >30 >30

aThe inhibitory activities of compounds were measured using the MTT assay. The data is shown by Mean±SD of 3 independent experiments.


결 론(Conclusion)

본 연구에서는 dasatinib 및 nilotinib의 molecular hybridization을 통해 약리활성이 확인된 약물의 key intermediate 구조 정보를 바탕으로 합성된 화합물 라이브러리를 이용하여 1세대 EGFRTKI에 대해서 내성을 보이는 비소세포폐암 세포주를 선택적으로 저해할 수 있는 저분자 유효물질을 발굴하고자 하였다. 기존에 보고된 T KI의 구조 정보를 바탕으로 화합물 라이브러리에서 효능이 우수한 화합물군을 선별하고, 4종의 폐암세포주와 1세대 EGFR-TKI 내성세포에서 sorafenib, imatinib, poziotinib, dasatinib, nilotinib와 비교하여 생존율 평가를 하였다. 그 결과 12가지 화합물 중에서 W3이 PC9 및 PC9GR에서 기존에 알려진 T KI보다 우수한 생존율저해 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발견은 암 치료에 새로운 가능성을 제시하며, 앞으로의 연구에서 해당 화합물의 잠재적인 임상 응용 가능성을 탐구할 수 있을 것으로 기대된다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Authors’ Positions

Kwang Il Kim : Postdoc researcher

So-Yeon Park : Postdoc researcher

Daeock Choi : Professor

Hangun Kim : Professor

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April 2024, 68 (2)
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