갱년기는 중년 여성에게 나타나는 노화의 증상으로 생식 기능이 저하되고 여성 성호르몬의 분비가 감소하면서 이로 인해 월경이 완전히 멈추는 시기를 의미하며, 대게 45~55세 사이에 나타난다.¹⁾ 특히 여성호르몬인 에스트로겐의 수준이 감소하는 것이 가장 큰 특징으로 알려져있다.²⁾ 호르몬의 변화와 함께 다양한 갱년기 증상이 나타나는데 대표적인 증상으로 안면 홍조, 수면 장애, 피곤, 우울증 등이 있다.³⁾ 위와 같은 갱년기 증상을 완화하기 위해 일반적으로 호르몬 요법으로 치료하고 있는데 갱년기로 인해 나타나는 심리적 증상 개선, 골다공증 예방, 심혈관 질환 예방 등에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 하지만 호르몬 요법으로 치료했을 시 에스트로겐의 과다로 자궁내막암, 심장질환과 유방암의 발생 빈도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾ 이와 같은 치료법의 부작용과 위험성을 방지하고자 천연물에서 유래한 갱년기 증상 개선 물질에 대한 개발이 필요해 보인다.

에스트로겐은 여성 생식 기관과 관련된 스테로이드 호르몬이며 여성의 성적 특성을 발달시키는 역할을 한다.⁷⁾ 또한 갱년기 치료에서 호르몬 대체 요법 (Hormone replacement therapy, HRT)을 가장 많이 사용하고 있으며 주로 골다공증, 관상 동맥 질환 및 사망률 감소에 효과를 보이지만 위험성도 함께 부각되고 있다.⁷⁾

작약은 미나리아재비과 작약속에 속하는 다년생 초본식물로서 한방에서 진통, 진경, 진행, 부인과약, 고혈압, 복통 및 염증 치료제로 많이 사용되어 왔다.⁸⁾ 주성분으로는 페오니플로린 (paeoniflorin), 페오놀 (paeonol) 및 알비플로린 (albiflorin) 등이 알려져 있다.⁹⁾

작약의 주성분 하나인 페오니플로린은 작약 내에 있는 약리 활성 성분이다.¹⁰⁾ 주로 항염증제, 항산화제,¹¹⁾ 항혈전제,¹²⁾ 항경련제,¹³⁾ 진통제,¹⁴⁾ 항우울제 및 면역 조절 활동을 포함하여 광범위한 약리학적 특정을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 갱년기 연구와 관련해서는 갱년기 우울증을 개선 시킨다는 Hongli Huang et al. 연구 결과가 있는데 갱년기로 인한 우울증 모델을 만들기 위하여 랫드의 난소를 절제하여 만성스트레스를 유발한 후 페오니플로린을 투여한 랫드에서는 corticotropin releasing hormone (CRH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), cortisol (CORT)와 같은 스트레스 지표 물질인 호르몬의 농도가 우울증 모델과 비교하였을 때 유의하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.¹⁵⁾

작약은 전통적으로 부인병 질환에 사용되어온 한약재지만, 부인병 질환에 관한 연구가 부족한 상황이다. 이러한 부인병 질환 연구에 앞서 먼저 기존의 작약 추출물이 가지는 낮은 경구 흡수율과 난소막 투과율을 개선하여 난소까지의 흡수율을 먼저 확인하고자 한다. 가용화제 개발을 위한 사전 실험에서 1% L-라이신을 사용하였을 때 소재의 가용화와 균질화가 높았다.¹⁶⁾ 따라서 본 실험에서는 새롭게 가용화한 페오니플로린과 기존의 페오니플로린 용액을 주사제와 경구제 투여 비교 실험을 통해 개선된 생체 이용률 및 난소내 농도를 확인하고자 한다.

페오니플로린 표준품

페오니플로린 표준품은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.에서 구입해 사용하였다.

분석 장비

원심분리기는 Labogene-Scanspeed 1736 R with rotor GRF-250-6 (6 × 250 ml)을 사용하였으며 HPLC의 경우Agilent1260를 사용하였으며, 컬럼은 Poroshell 120 EC-C18 2.7μm, 3.0*50 mm를 사용하였다. 이동상은 3차 증류수로 희석시킨 0.1% 포름산 수용액(이동상 A)과, 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴(이동상 B)를 사용하였다. 컬럼 온도는 30 ℃였으며, 유속은 0.5 ml/min으로 하였다. MS의 경우 Agilent 6410 QQQ(Agilent, 미국)를 사용하였다. 이온화는 양이온 모드였다. 이온화는 m/z 498.3 → 179.1, m/z 498.3 → 151.1으로 하여 분석하였다(Table 1). 입도 분석 장비 Nano ZS90(Malvern Panalytical, 오스트레일리아)로 분석을 진행하였다. 입도 분석 시 particle size detection range는 0.3 nm에서 10 μm로 설정하였다.

Table 1 HPLC and mass instrument operating condition

LC condition	Column	Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm, 3.0*50 mm
	Mobile phase	A	0.1% formic acid in DW
		B	0.1% formic acid in Acetonitrile
	Gradient	Time (min)	0	0.1	5	6	8	12
		Solvent B(%)	10	10	100	100	10	90
	Flow rate	0.5 ml/min
	injection volume	5 μl
	Column temp.	30 ℃
MS condition	Ionization Mode	Positive mode
	Ion Condition	m/z 498.3 → 179.1
		m/z 498.3 → 151.1
	Gas Temp	300 ℃
	CV	3,000 V
	CE	20 eV
	Nebulizer	40 psi

시료 전처리 방법

혈액은 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 혈장을 취하였다. 그다음, 혈장 200 μl를 취해 아세토니트릴을 2배 용량인 400 μl로 넣어 제단백 한 후, 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 이후, 상등액을 취해 질소 농축하여, 취한 혈장의 양과 동일하게 되도록 200 μl의 메탄올에 녹였다. 이후 시린지필터(0.2 μm)에 여과하여 시료를 조제 하였다.¹⁷⁾ 난소는 적출 직후 양쪽 난소의 무게를 측정하여, 그 무게의 5배의 saline을 녹여¹⁸⁾ 균질화하였다. 균질화가 끝난 후 시료를 전량 취하여, 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 하여, 상등액을 취하고, 상등액의 10%에 해당하는 4.5% 과염소산으로 제단백 했다. 이후 10,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음 상등액을 취해 질소농축 하였다. 농축 후, 처음 식염수의 부피와 동일한 양의 메탄올에 녹인 후, 시린지필터(0.2 μm)에 여과하여 시료를 조제 하였다.

Fig. 1. Process of extract paeoniflorin from paeony root powder

실험동물

Sprague Dawley Rat (SD rat)은 암컷 8주령을 효창사이언스에서 구입하였다. 랫드의 평균 무게는 약 240 ~ 260 g이었다. 일주일간 적응기간을 가졌으며, 사육실의 온도와 습도는 각각 23±1 ℃, 60±5%를 유지하였다. 또한 사육실의 조명은 매일 9:00부터 21:00까지 조명이 유지되도록 설정하였다. 본 연구에서 포함된 동물실험계획서는 경성대학교 동물윤리위원회에 의해 윤리성과 과학성에 대한 검토를 받아 적합한 것으로 승인 (동물윤리승인번호 : 연구-20-008A)을 획득하여 수행하였다.

작약 추출 후 가용화방법

작약은 에탄올로 추출하여 5분간 교반을 진행하였다. 이후 10,000 rpm, 4 ℃에서 10 min간 원심 분리를 진행하였고, 상등액과 펠릿을 각각 분리하여 상등액은 95 ℃에서 건조를 진행하였고 이후 에탄올에 녹여 추출물을 만들어 주었다. Pellet의 경우 1 차 증류수에 현탁 시켜 10,000 rpm (Labogene - Scanspeed 1736 R with rotor GRF-250-6 (6 × 250 ml), 4 ℃에서 10분간 원심 분리를 진행하였고 pellet을 다시 에탄올에 다시 현탁 시켰으며 현탁액은 동일한 조건으로 다시 원심분리를 진행하여 에탄올에 녹아 나온 상등액을 제일 처음의 상등액과 합하여 사용하였다. 이후 가용화를 위해 추출물의 농도를 3%로 설정하여 1.5% 라이신을 이용하여 가용화를 진행하였다. 가용화를 하지 않은 추출물은 추출물의 농도를 3%로 설정하고 1차 증류수로 희석하였다. 각각의 pH 8.0으로 맞춰 실험을 진행하였다.

가용화한 페오니플로린의 입도분석

추출물을 Ext+L solution (Ext+L) 과 Ext solution (Ext) 으로 나누어 입자분포를 확인하였다. Ext+L은 추출물 농도가 3%, 라이신 농도가 1.5%가 되도록 1차증류수로 희석하여 pH를 8.0으로 맞춰 입도분석을 시행하였다. Ext은 추출물 농도를 3% 되도록 1차증류수로 희석하여 pH를 8.0으로 맞춰 입도분석 및 흡광도 실험을 시행하였다. 입도분석 시 기기는 Nano ZS90 (Malvern)를 사용하였다. 시료는 가용화한 페오니플로린 용액을 액상입도 분석기로 분석하였다.

난소 흡수율 확인

가용화에 따른 난소 흡수율을 확인하기 위하여 Ext+L과 Ext으로 나누어 실험을 진행하였으며 페오니플로린은 두 그룹 모두 1 mg/ml으로 농도를 설정하여 I.P투여로 투여하였으며 투여 10분 후 에테르를 이용하여 마취를 진행하였고 이후 해부를 진행하여 혈액 및 난소를 적출하였다. 혈액은 후대정맥에서 채혈하였으며 이디티에이 관 (EDTA 관)에 옮긴 다음 원심분리하여 혈장을 취하였다. 난소의 경우 마취 후 복강을 개복하여 먼저 나팔관을 자른 후, 지방을 제거하여 적출하였으며 이후 코니칼튜브에 옮겨 무게를 측정한 후 호모게나이저을 이용해 균질화를 진행하였다.

생체 이용률 확인

가용화에 따른 생체 이용률을 확인하기 위하여 Ext+L과 Ext으로 나누어 실험을 진행하였으며 페오니플로린은 두 그룹 모두 6 mg/kg으로 대퇴정맥으로 투여하였으며 샘플링은 투여 후 각 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 120, 180 분에 경정맥혈관을 통해 혈액을 채취하였다. 경구투여는 60 mg/kg으로 투여하여, 각 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240, 300, 360 분에 경정맥혈관을 통해 혈액을 채취하였다. 혈액은 이디티에이 관에 옮긴 다음 원심분리하여 혈장을 취하였다. 약동학적 매개변수는 BA calc 2012를 이용해 계산하였으며, 생체 이용률 계산은 Fbioavailavility=AUCP.OAUCI.V×DoseI.VDoseP.O의 생체이용률 공식을 통해 계산하였다.

입자 크기 분석 및 흡광도 결과 (particle size analysis and absorbance result)

본 연구에서 사용한 작약 추출물인 Ext과 Ext+L의 입자 크기 및 물질 분산 정도를 확인하고자 입자 크기 분석과 흡광도 분석을 진행하였다. 작약 추출물 입자 크기 분석에서 Ext+L의 z-average는 458.33±7.06 nm였으며, PDI는 0.416±0.0245였고, Ext의 z-average는 482.33±46.57 nm였으며, PDI는 0.814±0.137였다. 또한 Peak 1, Peak 2의 경우, 작약을 추출하여 입도분석하였을떄 Main peak 2개를 분석하였다. EXT+L의 경우 476.57±36.75 nm에서 가장 많은 입자가 검출 되었고 다음으로 4853.67±185.86 nm에서 두번째로 많이 검출되었다. EXT의 경우에는 1231.06±875.10 nm에서 가장 많은 입자가 검출되었으며 다음으로 180.36±84.48 nm에서 검출되었다(Table 2). 작약 추출물 흡광도분석에서 광학 밀도 (OD) 값은 Ext+L의 경우 0.676, Ext의 경우 0.902로 나타났다(Table 3). 작약 추출물을 가용화를 진행하여 입도 분석 및 흡광도 측정결과 Ext+L의 경우 입도분포 PDI가 0.416으로 낮은 다분산 지표를 보였다. 이는 입도크기가 더 균질함을 의미한다(Table 2). 또한 흡광도 결과도 가용화된 페오니플로린이 0.676으로 Ext보다 0.902보다 낮게 나와 용해가 잘 된 것을 확인할 수 있었다(Table 3). 따라서 페오니플로린에 라이신을 첨가함에 따라 더 균질하게 용해가 잘 되는 것을 확인할 수 있다. 본 실험에서 사용한 라이신과 에탄올의 농도는 주사제로 임상이 가능한 아미노산, 에탄올 농도이하로 기준을 설정하였으며, 이러한 결과를 통하여 라이신은 가용화제로 사용이 가능함을 알 수 있었다.

Table 2 Result of particle size analysis

	Ext+L		Ext
Z-average (d.nm)	458.33±7.06		482.33±46.57
PDI	0.416±0.0245		0.814±0.137
	nm	% intensity	nm	% intensity
Peak 1	476.57±36.75	86.67±1.33	1231.06±875.10	67.83±8.36
Peak 2	4853.67±185.86	10.9±3.73	180.36±84.48	26.80±12.35

*Ext : Non-solubilized peaoniflorin extract

Ext+L : Peaoniflorin extract solubilized with L-Lysine

Table 3 Result of paricle OD value

	Ext+L	Ext
OD (600 nm)	0.676	0.902

*Ext : Non-solubilized peaoniflorin extract

Ext+L : Peaoniflorin extract solubilized with L-Lysine

난소 흡수율 확인 결과

작약 추출물 I.P투여에 따른 혈장 및 난소에서의 흡수율을 LC/MS 분석으로 확인하였다. 작약 추출물 I.P투여에 따른 Ext+L의 혈장 농도는 3862.32±616.29 ng/ml였으며, Ext은 2643.30±564.66 ng/ml로 나타났다. Ext+L의 난소 농도는 145.29±29.93 ng/ml였으며, Ext solution 군의 난소농도는 58.65±6.93으로 나타났다. 혈장 농도 대비 난소 농도는 Ext +L의 경우 3.76%, Ext의 경우 2.2%로 대조군인 Ext와 비교했을 때, Ext+L 이 170% 높은 흡수율을 나타났다(Table 4). 경구 투여에 따른 생체 이용률 측정에서 페오니플로린 흡수율은 2~3%로 낮은 흡수율을 보이는 것으로 보고되었고,¹⁸⁾ 본 실험실에서 사용한 가용화한 페오니플로린 추출물의 경우 경구 투여시 7.45%로 흡수율이 증가하였으며 이는 가용화한 페오니플로린 추출물의 경구 흡수율이 증가한 것으로 사료된다.^18,19)

Table 4 Paeoniflorin concentration and ratio in Ovary and plasma after intraperitoneal administration. (n=5)

Analysis part	Ext+L	Ext
Ovary Concentration (ng/ml)	145.29 ±29.93	58.6±6.93
Plasma Concentration (ng/ml)	3862.32±616.29	2643.30±564.66
Ratio(%)	3.76	2.2

*Ext : Non-solubilized peaoniflorin extract

Ext+L : Peaoniflorin extract solubilized with L-Lysine

Significant differences are indicated with ‘*’ at p<0.05 compared with EXT group.

가용화 페오니플로린의 생체 이용률 확인 결과

작약 추출물 정맥 주사 및 경구 투여에 따른 생체 이용률을 측정하였다. 정맥 주사에서 AUC 값은 4191.20±251.07이었으며, 경구 투여에서 AUC 값은 3122.66±199.64이었다. 이에 따른 F 값은 7.45%로 나타났다. 정맥 주사에서 C_max= 5173.80±51.74 였으며, 경구 투여에서 C_max= 1269.65±138.92로 나타났다(Table 5). 정맥 주사후 시간별 혈중농도와 경구 투여후 시간별 혈중농도를 Fig. 2,3 에 나타내었다.

Fig. 2. Plasma concentration-time curve of paeoniflorin in rat after I.V injection (n=4)

Fig. 3. Plasma concentration-time curve of paeoniflorin in rat after oral administration (n=4)

Table 5 Pharmacokinetic parameters of paeoniflorin in Rat (n=4 for each data point)

Ext+L	Oral administration	I.V injection
AUC (ng · hr/ml)	3122.66±199.64	4191.20±251.07
Tmax(min)	180	-
Cmax(ng/ml)	1269.65±138.92	5173.80±51.74
F (%)	7.45	100

*Significant differences are indicated with ‘*’ at p<0.05 compared with Oral administration group.

AUC : Area Under the Curve)

C_max(ng/ml) : C_max　refers to the peak or maximum concentration of a drug in the bloodstream

T_max(min):　T_max　indicates the time taken to reach that peak concentration after administration.

F (%) : F in pharmacokinetic parameters represents bioavailability, indicating how much a drug is absorbed and becomes effective in the body.

페오니플로린은 Paeonia lactiflora Pall에 함유되어있는 주요 약리 활성 성분이다.²⁰⁾ 작약은 항염증제, 항산화제, 항혈전제, 항경련제, 진통제 등으로 효과가 있다고 알려져있으며¹⁰⁾ 특히 전통적으로 부인병에 많이 사용되어왔던 약재이다.²¹⁾

흡광도를 이용한 입자 분석결과 작약 추출물을 라이신으로 가용화를 진행하였을 때 OD값은 0.676이며 가용화를 진행하지 않았을 때에는 0.902의 OD값을 보였다. 또한 I.P 투여하여 난소 흡수율을 관찰한 결과, 라이신으로 가용화한 추출물의 경우 혈장 농도는 3862.32±616.29 ng/ml, 난소 농도는 145.29±29.93 ng/ml로 혈장농도 대비 난소농도의 비는 3.75%였으며 가용화를 진행하지 않았을 때에는 혈장 농도는 2643.30±564.66 ng/ml, 난소 농도는 58.65±6.93 ng/ml로 혈장농도 대비 난소농도의 비는 2.2%로 라이신으로 가용화를 진행했을 시 난소 흡수율이 170% 증가하는 것을 확인하였다(Table 3).

생체 흡수율의 경우 라이신으로 가용화하여 I.V injection을 진행한 결과 AUC 값은 4191.20±251.07이며, 경구 투여에서의 AUC값은 3122.66±199.64이다. C Wang et al.의 연구에서²²⁾ 페오니플로린을 30 mg/kg으로 투여 했을 시 AUC 값은 58.36±17.20이었으며 본 연구의 경우 라이신으로 가용화하여 6 mg/kg을 대퇴 정맥으로 투여했을시 4191.20±251.07으로 AUC값이 증가한 것을 확인할 수 있었다(Table 4).

Lih-Chi Chen et al.의 연구에서²³⁾ 페오니플로린 10 mg/kg으로 경구투여했을 시 C_max값이 111.56 ng/ml으로 1%의 흡수율을 보였지만 본 실험의 경우 가용화한 페오니플로린 60 mg/kg으로 경구투여했을 시 C_max값이 1269.65 ng/ml로 18.96배의 높은 흡수율을 보였다. 또한 가용화했을 시 페오니플로린의 T_max가 180분으로 T_max가 기존결과보다 약 4~4.5배 이상 늘어난 것을 확인하였다.

본 실험에서의 입도 분석을 통해 페오니플로린의 균질화를 높혔지만 난소 흡수율과 생체 흡수율을 확인했을 때 단순히 균질화뿐만 아니라 다른 요인이 함께 작용했을 가능성이 있어 이에 대한 추가적인 실험이 필요하다.

본 연구는 보건복지부의 재원으로 한국보건산업진흥원의 보건의료기술 연구개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임 (과제고유번호 : HR20C0026)

모든 저자는 이해 상층을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Ye Jin Hwang: Ph.D. student

Hyeon Woo Kim: Ph.D. student

Ah Rum Kim: A master`s student

Jae Seon Kang: Professor