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Mechanism of Circular RNAs and Their Potential as Novel Therapeutic Agents in Retinal Vascular Diseases
Yakhak Hoeji 2023;67(6):325-334
Published online December 31, 2023
© 2023 The Pharmaceutical Society of Korea.

Hyunjong Kim* and Juhee Ryu*,**,#

*Vessel-Organ Interaction Research Center, College of Pharmacy, Kyungpook National University
**College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Kyungpook National University
Correspondence to: #Juhee Ryu, College of Pharmacy and Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Kyungpook National University, Daegu, Republic of Korea
Tel: +82539508583
E-mail: juheeryu@knu.ac.kr
Received October 12, 2023; Revised November 30, 2023; Accepted December 15, 2023.
Abstract
Maintaining and preserving visual function became critical in this aging society. The number of patients with retinal vascular disease such as retinopathy of prematurity, age-related macular degeneration, and diabetic retinopathy is gradually increasing due to increased life expectancy, advancements in the technology of delivering premature babies, and complications due to eating habits. To treat these retinal vascular diseases, surgical intervention such as laser photocoagulation and anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) drugs can be considered. However, these treatment options are accompanied by various complications and adverse effects. Thus, new treatments focusing on the pathogenesis of retinal vascular disease need to be developed. Various evidences suggest that circular RNA is involved in the pathogenesis of retinal disease. In this article, we discuss about currently used treatments of retinal vascular diseases and the emerging role of circular RNAs in the pathogenesis of retinal vascular diseases. Therefore, understanding the mechanism of circular RNA regulating retinal disease and developing therapeutics using these circular RNAs may offer novel treatment options to cure retinal vascular disease.
Keywords : Retinal vascular disease, Angiogenesis, Retinopathy of prematurity, Diabetic retinopathy, Age-related macular degeneration, MicroRNA, Circular RNA
서 론 (Introduction)

1. 망막 혈관 질환

망막은 신경세포 및 광수용기 세포를 포함한 여러 개의 층으로 이루어진 막으로, 눈의 가장 안쪽에 위치한 조직이다. 망막 조직은 혈관이 많이 있어 산소 및 대사 요구량이 높은데, 망막의 혈관에서 순환 기능 장애가 생기게 되면 혈액 공급이 원활하게 이루어지지 않아 산소 결핍 현상이 발생한다. 이는 망막의 혈관 신생(angiogenesis)을 야기하는 원인이 될 수 있다. 혈관 신생이란, 기존에 존재하던 혈관에서 새로운 모세혈관이 생기는 것을 일컫는데, 망막에 병적인 혈관신생이 발생하면 여러 망막 혈관 질환을 야기할 수 있다.1)

본 논문에서는 여러 혈관 신생 관련 망막질환 중에 대표적인 질환인 미숙아에게 발생하는 미숙아 망막병증 (retinopathy of prematurity, ROP), 당뇨병으로 발생하는 합병증인 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy, DR), 그리고 노인에게 발생하는 연령 관련 황반변성 (age-related macular degeneration, AMD)의 발병기전과 치료법 및 위 질환들을 조절하는 새로운 치료표적으로 떠오르는 비암호화 RNA에 대해 살펴보고자 한다.

1.1. 미숙아망막병증

미숙아 망막병증은 미숙아 또는 저체중 영아의 망막에 병적 신생혈관이 발생하는 질환이다. 산소 치료, 저체중, 재태 기간 등 다양한 요인들이 미숙아 망막병증의 위험 요인이 될 수 있다.2,3) 미숙아 망막병증은 고산소 환경에서 정상 혈관의 성장이 억제되는 단계와 저산소 환경에서 병적인 혈관신생이 일어나는 단계로 나눌 수 있다.4) 일반적으로 태아의 망막 혈관은 임신 16주차에 형성되기 시작하여 36주차가 되면, 망막 주변부까지 성장하게 된다.5) 미숙아의 경우, 망막의 혈관이나 폐 등 여러 기관들의 발달이 완료되지 않은 상태이므로, 인큐베이터에서 일정 기간 치료를 받게 된다. 이때, 인큐베이터 안의 환경은 일반 환경보다 상대적으로 산소 농도가 높은 환경이다. 고산소 환경은 혈관 내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 적혈구 형성 인자(erythropoietin, EPO), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor 1, IGF-1)를 억제하여 미숙아의 형성된 혈관의 손실과 정상적인 혈관 발달을 중단시킨다.6-9) 치료 후, 정상 농도의 산소가 존재하는 곳으로 오게 되면, 미숙아는 상대적으로 산소 농도가 낮은 환경에 직면하게 된다. 저산소 환경은 저산소증 유도 인자 (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α), 혈관 내피 성장 인자, 적혈구 형성 인자가 상향 조절하여 망막의 무혈관 영역에서 병적인 혈관 신생을 유도한다.10,11) 병적인 혈관 신생이 심해지면 섬유성 흉터 형성, 망막 박리로 이어질 수 있으며, 심할 경우, 실명을 유발한다.12)

현재 미숙아 망막병증 치료법으로는 외과적 수술인 레이저 광응고술과 혈관 내피 성장인자의 발현을 억제하는 약물인 항 혈관 내피 성장 인자(anti-VEGF) 약물을 사용하고 있다.13-16) 미숙아 망막병증 연구는 저산소증 환경에서 배양한 혈관 내피 세포 모델을 사용하거나 산소 유발 망막병증 (oxygen-induced retinopathy, OIR) 생쥐 동물 모델을 활용할 수 있다. 세포 모델의 경우, 이산화탄소를 통해 산소의 농도를 낮춘 후, 일정 시간동안 배양하여 사용한다. OIR 생쥐 동물 모델은 생쥐 출생 후 7일차 (P7) 부터 12일차 (P12)까지 75%의 산소에 노출하는데, 이때 고농도의 산소에 의해 중심 망막의 혈관 퇴행 및 혈관 성장 중단을 유발하게 된다. 생쥐 생후 12일차 이후부터는 다시 상대적 저산소 환경에 해당하는 실내 공기로 돌아가게 되는데 17일차 (P17)때 저농도의 산소에 의해 병적인 혈관 신생이 극대화된다.17-19)

1.2. 연령 관련 황반변성

연령 관련 황반변성은 망막 내 황반의 노화와 관련된 퇴행성 질환으로, 노인들의 실명을 야기하는 주요 원인 중 하나이다.20) 황반은 빛을 감지할 수 있는 광수용체가 밀집되어 있는 망막의 부위로, 시력의 대부분을 담당하고 있다.21) 나이나 유전적 요인, 산화 스트레스, 심혈관계 질환 등이 황반변성을 유발하는 위험 요인으로 지목된다.22-24) 연령 관련 황반변성은 망막 색소상피 세포의 위축과 드루젠이 형성되는 비삼출성 유형과 맥락막 혈관신생으로 인해 섬유성 흉터 및 실명을 야기하는 삼출성 유형으로 나눌 수 있다.25) 비삼출성 유형은 건성 노인 황반변성이라 불리는데, 드루젠이라는 노화 퇴적물이 망막 아래에 쌓이거나 망막 색소상피 세포의 위축으로 인해 황반의 시세포가 서서히 파괴된다. 이로 인해 황반의 시세포가 서서히 파괴되어 황반 기능 및 시력 저하가 야기된다.26) 삼출성 유형은 습성 노인 황반변성이라 불리며, 황반 아래층의 맥락막에 비정상적인 혈관신생으로 인해 출혈 및 부종을 야기하거나 흉터를 형성하여 시력에 영향을 준다.27)

현재 맥락막 혈관신생이나 연령 관련 황반변성 관련 치료법으로는 레이저 광응고술, 유리체 절제술, 항 혈관 내피 성장 인자 약물을 사용하고 있다.28) 연령 관련 황반변성 연구는 저산소 처리를 하거나 과산화수소, 요오드산 나트륨과 같은 약물을 배지에 처리하여 세포 모델을 사용하는데, 이는 산화 스트레스를 인위적으로 형성한 후, 세포를 배양하기 위함이다. 동물 모델의 경우 레이저로 맥락막 신생혈관을 유도한 생쥐 동물 모델을 사용한다. 이 경우, 망막 표피세포 및 브루크 막에 손상이 야기되는데, 이는 혈관신생을 유도하여 신생혈관성 연령 관련 망막병증의 병리학적 특징을 모형화한다.29-31)

1.3. 당뇨병성 망막병증

당뇨병성 망막병증은 당뇨병으로 인해 망막의 모세혈관이 손상되어 시각 장애 및 실명을 유발하는 질환으로, 당뇨병에 의해 발생하는 합병증이다.32) 당뇨병은 혈액과 망막 사이의 장벽을 구성하는 내피세포의 세포 간 접합을 파괴하여 혈관벽의 약화를 야기하는데, 이는 혈관 누출 및 기능 장애, 망막 혈관의 리모델링을 야기하여 비정상적인 신생 혈관을 유도한다.33,34) 당뇨병성 망막병증은 비증식성 단계와 증식성 단계로 나눌 수 있다. 비증식성 단계는 모세혈관 벽의 바깥쪽이 팽창하는 미세동맥류 형성, 신경 섬유층의 미세 경색인 솜털 반점 형성, 망막 내 미세혈관 이상 등이 나타나는데, 경증에서 중증으로 증가할수록 증식성 단계로 넘어갈 수 있다. 증식성 단계에서는 허혈 상태로 인한 신생혈관이 야기되는데, 이는 망막에서 유리체 방향으로 진행된다. 새로 형성된 혈관은 구조적으로 약하여 망막 및 유리체 출혈이 일어나기 쉽다. 또한, 유리체 부근에는 섬유혈관 조직이 존재하는데, 이는 수축하는 경향이 있다. 신생혈관이 유리체의 섬유성 조직에 고정되면 진행성 망막박리 및 견인성 망막박리를 유발하여 시력 손실을 유발할 수 있다.35) 현재 당뇨병성 망막병증 관련 치료법으로는 레이저 광응고술, 유리체 절제술, 항 혈관 내피 성장 인자 약물을 사용하고 있다.36-39)

당뇨병성 망막병증 연구는 고농도의 글루코스를 배지에 첨가하여 혈관 내피 세포를 배양하여 고혈당 환경에서 배양한 세포 모델을 이용한다. 동물 모델의 경우, 생쥐나 쥐를 일정 시간 공복 상태를 유지시킨 후 스트렙토조토신 (streptozotocin, STZ)을 생쥐 또는 쥐에 반복 주사하여 동물 모델로 사용한다. 스트렙토조토신은 활성산소를 생성하거나 DNA 손상을 야기하여 췌장의 β세포를 손상시키는 독소로 알려져 있으며, 이러한 기작으로 인해 당뇨병과 유사한 고혈당증을 유도할 수 있다.40-42)

2. 망막 혈관 질환 치료법 현황 및 한계점

망막혈관질환을 치료하기 위해 사용되는 대표적인 치료법으로는 외과적인 방법인 레이저 광응고 (laser photocoagulation) 수술과 Anti-VEGF 약물을 유리체 내에 주사하는 방법이 있다. 레이저 광응고 수술은 레이저를 이용하여 안구 혈관을 제거하는 방법으로, 주로 당뇨병성 망막병증을 치료하기 위해 사용되었다. 하지만, 레이저 광응고 수술은 시술 부위에 출혈 또는 흉터로 인한 시력 악화 및 시력 상실과 같은 부작용을 가지고 있다.43) 따라서, 현재 레이저 광응고 수술은 병증을 고려하여 심각한 수준일 때 시행되고 있다. Anti-VEGF는 혈관 신생을 유도하는 혈관 내피 성장 인자를 억제하는 약물로, 베바시주맙 (bevacizumab), 애플리버셉트 (aflibercept), 라니비주맙 (ranibizumab) 등이 있다. 혈관 내피 성장인자를 억제하게 되면, 눈과 시력에 손상을 줄 수 있는 혈관 신생을 줄이거나 예방할 수 있다. 또한, Anti-VEGF는 망막의 붓기나 출혈을 줄이기 위해 사용되기도 하는데, 습성 연령 관련 황반변성 및 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증 등의 질환에 anti-VEGF가 치료 목적으로 사용되는 것과 관련이 있다. Anti-VEGF 약물은 유리체액에 직접 약물을 투여하는 유리체강 주사 (intravitreal injection)를 통해 안구에 투여한다. 표적 부위에 약물을 직접 전달함으로써 약물의 부작용을 최소화할 수 있지만 유리체 및 망막에서의 출혈 가능성이 있으며, 안내염 및 망막 박리 등 크고 작은 부작용을 동반할 수 있다.44) 결론적으로, 레이저를 이용한 외과적 개입이나 Anti-VEGF를 이용한 치료는 치료적 이점이 있으나. 망막 박리 또는 실명이라는 심각한 부작용을 동반할 수 있다. 따라서, 기존의 치료법을 상회하는 치료적 이점을 가지면서 부작용을 최소화하는 새로운 치료법이 필요하다.

3. 원형 RNA

원형 RNA (circular RNA, circRNA)는 비암호화 RNA 중 하나로 비암호화 RNA (noncoding RNA, ncRNA)는 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자로 알려져 있다. 비암호화 RNA의 발현은 단백질을 암호화하고 있는 유전자의 발현에 단기간 또는 장기간 영향을 줄 수 있다.45,46) 비암호화 RNA는 길이가 200 뉴클레오타이드 (nucleotide, nt) 미만인 그룹과 200nt 이상인 그룹으로 분류할 수 있다. 200nt 미만인 그룹에는 마이크로 RNA (micro RNA, miRNA), 200nt 이상인 그룹에는 긴 비암호화 RNA (long noncoding RNA, lncRNA), 그리고 다양한 길이를 가지고 있는 원형 RNA 가 있다.47,48)

원형 RNA는 폐쇄된 형태인 고리 모양을 가진 단일 가닥의 RNA이다.49) 주로 전사체의 엑손 또는 인트론 서열에서 역 스플라이싱을 통해 생성되며, 엑손 부위로만 구성된 원형 RNA (exonic circRNAs, EcRNAs), 엑손과 인트론 부위를 가지고 있는 원형 RNA (exon–intron circRNAs, EIciRNAs), 인트론 부위로만 구성된 원형 RNA(intronic circRNAs, ciRNAs)로 구분할 수 있다 (Fig. 1).50-52) 원형 RNA는 전사 조절, 마이크로 RNA의 스펀지, 단백질 번역에 관여하는 기능이 있다. 전사 조절 기능은 핵 안에 존재하는 원형 RNA에 국한된 기능이다. 핵에 존재하는 원형 RNA가 U1 소핵 리보핵단백질 (U1 small nuclear ribonucleoprotein, U1 snRNP)과의 상호작용을 통해 복합체를 형성하게 되고, 형성된 복합체가 RNA 중합효소와의 상호작용을 통해 전사를 촉진하게 된다.53) 마이크로 RNA 스펀지 기능은 세포질에 존재하는 원형 RNA의 기능이다. 마이크로 RNA는 표적 RNA인 메신저 RNA (messenger RNA, mRNA)와 결합하여 메신저 RNA의 발현을 억제할 수 있는데, 원형 RNA가 마이크로 RNA와 결합함으로써 메신저 RNA의 유전자 발현이 상대적으로 증가된다.54,55) 또한, 원형 RNA는 단백질 번역에 관여할 수 있는데, 이 기능은 개방형 해독틀 (open reading frame, ORF)과 리보솜에 결합이 가능한 부위를 가지고 있는 일부 원형 RNA에서만 확인되었다. 이러한 원형 RNA는 내부 리보솜 도입 서열 (internal ribosome entry site, IRES)에 의존적인 번역이나 메신저 RNA의 대사를 조절한다고 알려져 있는 m6A 변형에 의존적인 번역을 통해 단백질 번역을 수행할 수 있다.56,57)



Fig. 1. Schematic diagram of circular RNA (circRNA) biogenesis.
(A) Linear RNAs are formed by canonical splicing of pre-mRNAs. (B) CircRNAs are formed by back-splicing. Exon-intronic circRNA are derived from both exons and introns. (C) Exonic circRNA are derived from one or several exons.
원형 RNA를 이용한 망막혈관질환 연구

최근 몇 년 동안 망막 발달 과정 또는 망막 질환에서 원형 RNA의 역할에 대해 많은 연구가 이루어졌다. 특히, 원형 RNA는 선형 RNA 전사체에 비해 망막 질환에 높은 반응성을 보이는데, 이는 원형 RNA의 특이성 및 다양성이 복잡한 생리적 기작에 관여한다는 것을 의미한다.58) 따라서, 망막 혈관 질환의 발병 기전에서 원형 RNA의 역할에 대해 알아보고자 한다 (Table 1, Fig. 2).



Fig. 2. circular RNAs (circRNAs) in retinal vascular disease.
Several circRNAs were identified to be involved in retinopathy of prematurity, age-related macular degeneration, and diabetic retinopathy. Expressions of circRNAs and their regulatory axes including miRNAs and mRNAs are indicated using arrows. Red arrows indicate up-regulation, while blue arrows show down-regulation. Refer to Table 1 for more details regarding these regulatory relationships.

Circular RNAs regulating retinal vascular diseases
Disease circRNA Target miRNA Expression Study model Function Mechanism of action Reference
ROP circZNF609 miR-615-5p Up In vitro) Hypoxia-treated HUVEC Promotes cell proliferation, migration and tube formation Regulates MEF2A expression by acting as a sponge for miR-615-5p 59)
In vivo) OIR mouse
circPDE4B miR-181c Down In vitro) Hypoxia-treated HREC Suppresses cell proliferation and tube formation Modulates VHL expression by acting as a sponge for miR-181c and facilitatethe ubiquitin degradation of HIF-1α 61)
In vivo) OIR mouse
AMD circZBTB44 miR-578 Up In vitro) CoCl2-treated RF/6A Promotes cell proliferation, migration and tube formation Acts as a sponge for miR-578 and upregulates expression of VEGFA and VCAM1 63)
In vivo) Laser-induced CNV mouse
circNR3C1 miR-382-5p Down In vitro) NaIO3-treated ARPE-19 Increases expression of epithelial-specific marker and decreases cell proliferation Sponges miR-382-5p and regluates expression of PTEN/AKT/mTOR 67)
In vivo) C57BL/6 mouse
DR circZNF532 miR-29a-3p Up In vitro) high glucose medium cultured Human retinal pericyte and HRVEC Promotes cell viability and pericyte function Acts as a sponge for miR-29a-3p and increases expression of NG2, LOXL2 and CDK2 71)
In vivo) STZ-induced diabetic mouse
circHIPK3 miR-30a-3p Up In vitro) high glucose medium cultured HRVEC Promotes cell viability, proliferation, migration and induces tube formation Acts as an endogenous miR-30a-3p sponge and upregulates expression of VEGFC, FZD4, WNT2 75)
In vivo) STZ-induced diabetic mouse
circDNMT3B miR-20b-5p Down In vitro) high glucose medium cultured HRMEC Upregulates expression of tight junction-related protein and promotes cell proliferation and migration Regulates BAMBI expression by acting as a sponge for miR-20b-5p 74)
In vivo) Diabetic rat model

Abbreviations: AKT, Protein kinase B; AMD, Age-related Macular Degeneration; ARPE-19, Arising Retinal Pigment Epithelia-19 cell; BAMBI, BMP and Activin Membrane-Bound Inhibitor homolog; CDK2, Cyclin-Dependent Kinase 2; CNV, Choroidal Neovascularization; DR, Diabetic Retinopathy; FZD4, Frizzled class receptor 4; HIF, Hypoxia-Inducible Factor; HREC, Human Retinal Endothelial Cell; HRMEC, Human Retinal Microvascular Endothelial Cells; HRVEC, Human Retinal Vascular Endothelial Cell; HUVEC, Human Umbilical Vein Endothelial Cell; LOXL2, Lysyl Oxidase Like 2; MEF2A, Myocyte Enhancer Factor 2A; mTOR, mammalian Target Of Rapamycin; NG2, Neural/Glial antigen 2; OIR, Oxygen-Induced Retinopathy; PTEN, Phosphatase and Tensin homolog; ROP, Retinopathy Of Prematurity; STZ, Streptozotocin; VCAM1, Vascular Cell Adhesion Molecule 1; VEGFA : Vascular Endothelial Growth Factor-A; VEGFC, Vascular Endothelial Growth Factor-C; VHL, Von Hippel-Lindau; WNT2, Wnt family member 2



1. 미숙아 망막병증을 조절하는 원형 RNA 연구

첫번째로 미숙아 망막병증 연구로는 원형 RNA ZNF609 (circZNF609)가 미숙아 망막병증을 촉진한다고 보고한 연구가 있다. circZNF609의 기능은 저산소 스트레스 처리를 한 인간 탯줄 정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 및 산소 유도 망막병증 생쥐 모델을 통해 연구되었다. 미숙아 망막병증 모델에서 circZNF609의 발현이 증가하였다. 산화 또는 저산소 스트레스를 받은 세포 모델에서 circZNF609를 침묵시키게 되면 산화 또는 저산소 스트레스로 인한 세포 사멸이 감소하였다. 또한, 동물 모델에서 circZNF609를 침묵시키면 망막의 무혈관 영역이 감소하였다. 이는 circZNF609의 발현을 침묵시키는 것이 내피세포가 산화 또는 저산소 스트레스로 인한 데미지를 극복하여 혈관 손상이 줄게 되고, 병적인 혈관 신생이 감소한다고 생각할 수 있다. 그리고 생물정보학 데이터베이스를 활용하여 circZNF609와 결합가능한 상호 인자로 마이크로 RNA 615-5p (miR-615-5p)를 예측할 수 있었고, miR-615-5p를 과발현시켰을 때 망막 혈관의 손실 및 병적인 혈관 신생이 억제되는 것을 확인하였다. miR-615-5p의 표적 유전자로 근세포 증강 인자 2 (myocyte enhancer factor 2A, MEF2A) 가 예측되었고, 세포 모델에서 circZNF609의 발현이 감소하면 MEF2A의 발현도 감소하였다. 따라서, 해당 연구에서는 circZNF609와 miR-615-5p, MEF2A의 신호 기전이 내피 세포의 기능에 영향을 미쳐 병적인 혈관 신생을 조절할 수 있음을 밝혔다.59)

다음으로, 원형 RNA PDE4B (circPDE4B)는 신생혈관 생성을 억제한다는 연구가 보고되었다. circPDE4B는 저산소 처리한 인간 망막 내피세포 (human retinal endothelial cells, HRECs) 및 산소 유도 망막병증 생쥐 모델에서 발현이 감소하였다.60,61) 세포 모델에서 circPDE4B의 발현을 침묵시키면 세포의 증식, 혈관 형성, 저산소증 유도 인자 및 혈관 내피 성장 인자 A의 발현이 증가했다. 이는 circPDE4B가 저산소증에 의한 혈관 신생과 관련이 있음을 의미한다. 또한 해당 연구자들은 생물정보학 분석을 통해 circPDE4B의 상호인자가 마이크로 RNA 181c (miR-181-c)이며, miR-181-c의 상호인자가 VHL (von Hippel–Lindau)임을 확인하였다. VHL은 저산소증 유도 인자의 분해와 관련이 있는 것으로 알려져 있으며, 저산소 처리한 세포 모델에서 miR-181-c의 발현 증가하고 VHL의 발현 감소를 확인하였다.62) 이러한 결과를 토대로, circPDE4B와 miR-181-c의 결합으로 인해 VHL에 의한 유비퀴틴 분해가 촉진되고, 저산소증 유도 인자가 분해된다는 것을 알 수 있다. 따라서, circPDE4B와 miR-181-c, VHL로 이어지는 신호 경로를 통해 저산소증을 억제할 수 있고, 병적인 혈관 신생을 조절할 수 있다.61)

2. 연령 관련 황반변성을 조절하는 원형 RNA 연구

첫번째로 원형 RNA ZBTB44 (circZBTB44)가 삼출성 연령 관련 황반변성을 촉진한다고 보고한 연구가 있다. circZBTB44의 기능은 저산소 환경에서 배양한 원숭이 망막에서 추출한 내피세포 (RF/6A) 및 레이저를 통해 맥락막 신생혈관을 유도한 생쥐 모델에서 연구되었고, circZBTB44의 발현은 세포 및 동물 모델에서 증가하였다. 세포 모델에서 circZBTB44의 발현을 침묵시키면 세포의 생존력 및 증식, 이동, 혈관 형성이 감소하였다. 동물 모델의 경우, circZBTB44의 발현 침묵으로 인해 신생 혈관의 길이 및 영역이 감소하였다. 맥락막 신생혈관이 유도된 동물 모델에 circZBTB44의 발현을 침묵시킬 경우 맥락막의 발아 면적이 감소하였다. 또한 생물 정보학 분석을 통해 circZBTB44의 상호인자로 마이크로 RNA-578 (miR-578), miR-578의 상호 인자로 혈관 내피 성장인자 A와 혈관 세포 접착 분자 1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM1)를 예측하였다. miR-578을 과발현시키면 세포 생존력 및 증식, 증식, 이동, 혈관 형성이 세포모델에서 감소하였고, 신생 혈관 면적이 동물모델에서 감소하였다. 또한, circZBTB44를 침묵시키거나 miR-578을 과발현시키면 세포 증식 및 혈관 내피 성장인자 A, 혈관 세포 접착 분자 1의 발현이 감소하였다. 마지막으로, 다른 안과 질환 환자 검체보다 삼출성 연령 관련 황반변성 환자의 검체에서 circZBTB44 및 혈관 내피 성장인자 A, 혈관 세포 접착 분자 1의 발현이 높았다. 따라서, 해당 연구를 통해 circZBTB44는 miR-578 및 혈관 내피 성장인자 A, 혈관 세포 접착 분자 1과의 상호작용을 통해 삼출성 연령 관련 황반변성의 진행을 조절할 수 있음을 밝혔다.63)

두번째로, 원형 RNA NR3C1 (circNR3C1)이 위축성 연령 관련 황반변성을 억제한다고 보고한 연구가 있다. circNR3C1의 기능은 과산화수소 또는 요오드산나트륨을 처리한 망막 색소 상피세포 (ARPE-19)에서 연구되었고, circNR3C1의 발현은 세포 모델에서 감소하였다. 세포 모델에서 circNR3C1의 발현을 침묵시키면 망막 내피세포 특이적 마커인 ZO-1 (zonula occludens-1), CTNNB1 (catenin beta 1), BEST1 (bestrophin 1), KRT18 (cytokeratin-18), MERTK (proto-oncogene tyrosine-protein kinase MER)의 발현과 식균작용이 감소하였고, ROS (reactive oxygen species) 생성 및 세포 증식이 증가하였다. 다음으로, 생물정보학 분석을 통해 circNR3C1의 상호 인자로 마이크로 RNA-385-2-5p (miR-382-5p)를 예측하였다. miR-382-5p를 과발현시킨 세포 모델에서 망막 내피세포 특이적 마커들의 발현과 식균 작용이 감소하였고, ROS 생성 및 세포 증식이 증가하였다. miR-382-5p의 상호 인자로는 PTEN (phosphatase and tensin homolog on chromosome 10)이 예측되었는데, miR-382-5p와 PTEN, 망막 퇴행 간의 관련성에 대한 선행 연구를 참고하였다.64-66) 세포 모델에서 circNR3C1을 침묵시키면 PTEN의 단백질 발현이 감소하였고, PTEN의 하위 기전인 AKT와 mTOR의 발현이 증가되었다. 이러한 결과는 망막 내피세포 특이적 마커들의 발현 감소와 ROS 생성, 세포 증식의 증가로 이어졌다. 마지막으로, 대조군 동물 모델에 circNR3C1을 침묵시키거나 miR-382-5p를 과발현시키면 망막 내피세포 층이 두꺼워지고, 망막 내피세포 특이적 마커들의 발현이 감소하였다. 따라서, circNR3C1과 miR-382-5p, PTEN 신호 경로는 AKT/mTOR 경로 조절을 통해 망막 내피세포의 기능을 조절할 수 있다.67)

3. 당뇨병성 망막병증을 조절하는 원형 RNA 연구

첫번째로, 원형 RNA ZNF532 (circZNF532)가 당뇨병성 망막병증을 촉진한다고 보고한 연구가 있다. circZNF532의 기능은 고혈당 배지에서 배양한 인간 망막 주피세포 (human retinal pericyte cells, HRPC) 및 인간 망막 혈관 내피세포 (human retinal vascular endothelial cells, HRVECs), 스트렙토조토신으로 당뇨병성 망막병증을 유도한 생쥐 모델에서 연구되었고, circZNF532의 발현은 세포 모델 및 동물 모델에서 증가하였다. 세포 모델에서 circZNF532의 발현을 침묵시키면 세포의 생존력과 증식, 혈관 주위세포가 혈관 내피세포로 모이는 특성, 혈관 주위세포 특이적인 마커인 PDGFR-β (platelet-derived growth factor receptor β), α-SMA (alpha-smooth muscle actin), Desmin, 및 NG2 (nerve/glial-antigen 2)의 발현이 감소하였고 세포의 투과도 및 세포 사멸이 증가하였다. 동물 모델에서 circZNF532 발현을 침묵시키면 망막에 분포된 혈관 주위세포가 감소하고, 망막 투과도와 망막 내 미세 동맥류 및 무혈관 영역, 혈관 주위세포가 소실되는 양이 증가하였다. 이후, 생물정보학 분석을 통해 circZNF532의 상호인자로 마이크로 RNA 29a-3p (miR-29a-3p), miR-29a-3p의 상호 인자로 CSPG4 (chondroitin sulfate proteoglycan 4, NG2), LOXL2 (lysyl oxidase like 2), CDK2 (cyclin-dependent kinase 2)를 예측하였다. CSPG4와 LOXL2, CDK2는 세포의 분화 및 이동, 증식에 관여하는 유전자로 알려져 있다.68-70) 세포 모델 및 동물 모델에서 circZNF532 발현을 침묵시키거나 miR-29a-3p의 발현을 증가시키면 CSPG4와 LOXL2, CDK2의 발현이 감소하였다. 마지막으로, 중증의 당뇨병성 망막병증 환자에서 circZNF532의 발현 및 세포 사멸, 혈관 투과도가 높고, 혈관 주위세포의 분포가 낮았다. 따라서, 이 연구에서는 고혈당 및 산화 스트레스에 의해 발현이 증가된 circZNF532가 miR-29a-3p와 NG2, LOXL2, CDK2로 이어지는 신호 경로를 통해 혈관 주위세포의 변성 및 기능 장애를 조절할 수 있음을 밝혔다.71)

다음으로 원형 RNA DNMT3B (circDNMT3B)가 당뇨병성 망막병증에 의한 망막 혈관 기능 장애로부터 망막 내피세포를 보호하는 기능이 있다고 보고한 연구가 있다. circDNMT3B의 기능은 고혈당 배지에서 배양한 인간 망막 미세혈관 내피세포 (human retinal microvascular endothelial cells, HRMEC) 및 스트렙토조토신으로 당뇨병성 망막병증을 유도한 쥐 모델에서 연구되었다. 우선, 망막의 내피세포에서 발현되는 여러 마이크로 RNA 중에서 마이크로 RNA-20b-5p (miR-20b-5p)가 당뇨병 세포 모델 및 동물 모델에서 증가한다는 선행 연구를 확인하였다.72,73) 이를 토대로, 세포 모델에서 miR-20b-5p의 발현을 억제하면 세포 간 접착과 관련이 있는 ZO-1, Occludin, Claudin-5의 발현과 세포의 증식, 이동성이 증가하는 것을 확인하였다. 이후, 생물 정보학 분석을 통해, miR-20b-5p와 상호 작용할 수 있는 원형 RNA 및 유전자로 circDNMT3B와 BAMBI (BMP and activin membrane bound inhibitor)를 예측하였다. 세포 모델에서 circDNMT3B를 과발현시키면 miR-20b-5p의 발현이 감소하고, BAMBI의 발현은 증가하였다. 또한, 세포 및 동물 모델에서 circDNMT3B를 과발현시키면 세포의 증식과 이동, 혈관 형성이 감소하고, 망막 혈관의 손상이 감소하였다. 이는 circDNMT3B로 인해 당뇨병성 망막병증으로 인한 시각적 손상이 개선되었음을 의미한다. 마지막으로, 당뇨병성 망막병증 환자 검체에서 circDNMT3B의 발현이 감소하였고, miR-20b-5p의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 해당 연구에서는 circDNMT3B는 miR-20b-5p 및 BAMBI와 신호 경로를 형성하여 망막 혈관 기능 장애를 조절해 당뇨병성 망막병증의 진행에 관여할 수 있음을 밝혔다.74)

마지막으로, 원형 RNA HIPK3 (circHIPK3)가 당뇨병성 망막병증을 촉진한다고 보고한 연구가 있다. circHIPK3의 기능에 대해 연구하기 위해 고혈당의 배지에서 배양한 인간 망막 혈관 내피세포와 스트렙토조토신으로 당뇨병성 망막병증을 유도한 생쥐 모델을 사용하였고, 세포 및 동물 모델에서 circHIPK3의 발현이 증가하였다. 세포 모델에서 circHIPK3의 발현을 침묵시키면 세포의 생존력 및 증식, 이동, 혈관 형성이 감소하였다. 생물 정보학 분석을 통해 circHIPK3의 상호 인자로 마이크로 RNA-30a-3p (miR-30a-3p)가 예측되었으며, miR-30a-3p의 상호 인자로 혈관 내피세포 성장 인자 C (vascular endothelial growth factor-C, VEGFC)와 FZD4 (frizzled 4), WNT (wingless-related integration site)가 예측되었다. 세포 모델에서 miR-30a-3p를 과발현시키면 세포 생존력 및 증식, 이동, 혈관 형성, VEGFC와 FZD4, WNT의 발현이 감소하였다. 동물 모델에서 circHIPK3을 침묵시키면 무세포 모세혈관 및 혈관 누출, 염증 관련 인자인 IL-2 (interleukin–2), IL-3, 단핵구 화학유인 단백질-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), VEGF의 발현이 감소하였다. 마지막으로, 다른 안과질환 환자의 검체보다 당뇨병성 망막병증 환자의 검체에서 circHIPK3의 발현이 높았다. 따라서, 해당 연구에서는 circHIPK3는 고혈당 환경에서 발현이 증가하며, miR-30a-3p 및 VEGFC, FZD4, WNT와의 신호 경로를 통해 당뇨병성 망막병증의 진행을 촉진하여 망막의 혈관 기능을 조절할 수 있음을 밝혔다.75)

망막 질환 진단 및 치료를 위한 원형 RNA 활용 가능성

현재 사용되고 있는 망막질환 치료법들을 대체할 수단으로 RNA 기반의 치료법이 주목을 받고 있다. 특히, 원형 RNA와 같은 비암호화 RNA가 망막 질환과의 상관관계가 있음이 여러 연구들을 통해 밝혀지고 있으며, 이에 기반한 후속 연구 및 임상이 진행중에 있다.

원형 RNA를 이용하여 망막 질환을 치료하고자 임상에 들어간 경우는 아직까지 확인되지 않았지만, RNA 기반의 치료제를 이용하여 망막 질환을 치료하고자 임상 시험을 한 사례는 존재한다. RNA 간섭 기반의 베바시라닙 (Bevasiranib)은 VEGFA의 합성을 억제하는 항-VEGF 약물로, 황반변성 및 연령 관련 황반변성 환자를 대상으로 임상 3상까지 진행되었다. 임상 결과, 베바시라닙은 기존에 존재하는 VEGF를 제거하는 것이 아닌, 새로운 VEGF의 합성을 억제하는 효과를 보이므로 기존의 VEGF를 제거할 수 있는 약물과의 병용 요법으로 사용 가능성이 제기되었다.76,77) 다음으로, 맥락막 신생혈관을 억제하여 연령 관련 황반변성을 치료하기 위해 개발된 siRNA-027인 AGN211745이 임상 2상까지 진행되었다. siRNA-027은 VEGF 수용체에 결합하는 길항제로 임상시험 결과 환자들의 시력 및 황반 두께의 개선이 확인되었다.76,77) 마지막으로 PF-04523655는 저산소증 유도 유전자인 RTP801의 발현을 억제하는 RNA 간섭 기반의 약물로, 당뇨병성 황반부종 및 연령 관련 황반변성을 대상으로 임상 2상까지 진행되었다. 임상 결과, 용량 의존적으로 시력이 개선됨을 확인하였으며, 최적의 용량을 결정하고자 임상 3상을 계획 중에 있다.76,77) 이렇듯, RNA 기반 약물들을 망막 질환 치료제로서 사용하고자 임상시험이 진행된 사례를 바탕으로, 향후에는 원형 RNA를 이용한 망막 질환을 표적으로 하는 임상 시험 또한 가능할 것으로 예상된다.

또한, 원형 RNA를 췌담도암이나 신경 내분비암, 유방암 등의 진단에 활용하고자 환자의 혈액을 통해 원형 RNA을 탐색한 관찰 연구 (observational study) 단계의 임상 사례가 있으며, 당뇨병성 망막병증의 진단을 위한 바이오마커 발굴을 위해 환자의 혈액에 존재하는 엑소좀 내 마이크로 RNA의 기능을 파악하기 위해 관찰 연구를 계획중인 임상 사례와 환자의 혈액으로 마이크로 RNA 시퀀싱 (miRNA sequencing)을 하여 관찰 연구를 진행하려는 임상 시험도 있다.78-80)

따라서, 망막 질환을 표적으로 원형 RNA를 치료적 목적으로 사용하기 위해 임상 시험이 진행된 경우는 없지만, RNA 기반의 약물이나 비암호화 RNA을 이용하여 망막 질환의 진단 또는 치료제로서의 사용을 검토하고자 임상에 들어간 사례들이 있다. 또한, 암과 같은 질환에서는 원형 RNA를 진단을 위한 바이오마커로 사용하고자 임상에 착수중인 경우가 있으므로, 향후 원형 RNA가 망막 질환에서 진단 바이오마커 또는 치료제로 활용 가능할 것으로 예상된다.

결 론 (Conclusion)

망막혈관질환을 치료하기 위해 외과적 수술 및 항-VEGF 약물을 이용하는 것은 많은 환자들의 병증을 완화하는데 도움을 주었다. 하지만, 시술 부위의 출혈 및 흉터나 약물로 인한 안구 내 염증으로 인해 망막 박리 또는 시력 손상이라는 심각한 부작용을 동반할 수 있다. 이렇듯, 망막 혈관 질환을 치료하기 위한 기존의 치료법들은 한계가 명확하게 드러나 있는 상황이다. 그러므로, 환자들의 병증 완화 및 안정성을 높일 수 있는 새로운 치료법이 개발될 필요가 있다.

본 논문은 원형 RNA가 망막 질환의 발병기전에 영향을 미친다는 연구 결과를 토대로, 원형 RNA의 망막 질환의 진단을 위한 바이오마커 또는 치료제로의 개발 가능성에 주목하고자 한다. RNA 기반 약물의 장점은 기존 약물로 표적화하기 어려웠던 대상을 표적화하는 것이 가능하다는 점이다.81) 원형 RNA는 5' 및 3' 말단이 없는 폐쇄된 원형 구조를 가지고 있다. 이러한 구조적 특성으로 인해 핵산외부가수분해효소 (exonuclease)에 의한 분해에 덜 민감하여 생체 내에서 안정적인데, 이는 선형 구조의 메신저 RNA 약물보다 보관이 용이하고 수명 또한 길다는 장점과 연관이 있다.82-84) 또한, 원형 RNA는 조직 특이적으로 발현되고 전사 및 전사 후 과정에 관여할 수 있어 여러 질병에 대한 바이오마커로서의 가능성이 있다.82,84,85) 기능적으로, 원형 RNA는 마이크로 RNA와의 상호작용을 통해 메신저 RNA의 번역을 조절할 수 있는데, 이를 기반으로, 적은 양의 원형 RNA를 사용하여 질병과 관련있는 메신저 RNA의 번역을 조절하는 치료 패러다임을 구축할 수 있다.82-85) 따라서, 원형 RNA는 망막 질환을 진단하거나 예후를 예측하는 바이오마커 또는 원형 RNA의 발현을 조절하는 치료제로서의 유망한 가능성이 있으며 새로운 치료 패러다임을 제시할 수 있다.

기존에 사용되는 망막 질환 치료제들은 안구 내 주사를 통해 투여되어 여러 부작용이 있었다. 이러한 점을 개선하기 위해, 원형 RNA를 이용한 약물 개발 단계에서 점안액 제형으로의 개발을 염두에 둘 수 있다. 점안액 제형은 주사로 투여되는 기존의 방식보다 안구에 가해지는 자극이 덜하며, 투여 방법 또한 간단하다는 장점이 있다. 일례로, 일본에서 녹내장 치료에 사용되었던 약물인 리파수딜 점안액 (ripasudil)을 미숙아 망막병증 치료 목적으로 사용하고자 임상 2상까지 진행한 바 있으며, 소분자 기반 약물인 EXN 407은 당뇨병성 황반부종을 표적으로 임상 2상까지 진행되었다(NCT04621136, NCT04565756). 또한, 맥락막 신생혈관에 대한 치료제로서 siRNA를 이용한 점안액인 SYL18001이 임상 1상을 진행한 사례가 있다(NCT04782271). 그러므로, 원형 RNA의 장점을 기반으로 점안제 제형으로의 약물 개발이 가능할 것이라 생각한다. 결론적으로, 원형 RNA에 대한 지속적인 연구는 망막질환에서 새로운 진단 및 치료법 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 과학기술정보통신부(한국연구재단, NRF-2021R1C1C2009289, 2020R1A5A2017323) 및 2023년 (재)동일문화장학재단 학술연구조성비 지원에 의해 수행되었으며, 이에 감사를 드립니다. 그림 12는 Biorender.com를 이용하여 제작되었다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Authors’ Positions

Hyunjong Kim : Graduate student

Juhee Ryu : Professor

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December 2023, 67 (6)
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