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Development and Evaluation of HPLC-UV Method for Astaxanthin in Health Functional Foods Code
Yakhak Hoeji 2023;67(5):311-317
Published online October 31, 2023
© 2023 The Pharmaceutical Society of Korea.

Yooseong Jeong*, Junghoon Shin*, Yong Seok Choi**, Sang Beom Han*, and Dong-Kyu Lee*,#

*College of Pharmacy, Chung-Ang University
**College of Pharmacy, Dankook University
Correspondence to: #Dong-Kyu Lee, College of Pharmacy, Chung-Ang University, Seoul 06974, Republic of Korea
Tel: +82-2-820-5854
E-mail: leedk@cau.ac.kr
Received August 30, 2023; Revised October 20, 2023; Accepted October 23, 2023.
Abstract
The HFF (Health Functional Foods) Code provides protocols for the quantitative analysis of 68 types of HFF ingredients. Astaxanthin is one of the HFF with antioxidant properties, preventing cell damage and reducing eye fatigue, becoming popular in the HFF market. To improve the astaxanthin assay protocol, we changed the LC condition from a tertiary pump to a binary pump and optimized the mobile phase and gradient accordingly. Based on the differences in the enzymes, we also observed the efficiency of the conversion of astaxanthin ester to free astaxanthin. We validated our modified method based on AOAC guidelines, including linearity (R2≥0.99), selectivity, accuracy (recovery 92~105%), and precision (%RSD≤2). An applicability was evaluated on 15 health functional food products, and the recovery values were satisfied within the range of 80-120%. In this study, we modernized the analytical method of astaxanthin by modifying the LC conditions, and standardized the cholesterol esterase with the highest efficiency.
Keywords : Astaxanthin, Health Functional Foods (HFF) Code, Liquid chromatography, Ultraviolet detector
서 론(Introduction)

아스타잔틴(C40H52O4, 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4' dione)은 카로티노이드계 적색 색소로 의약품, 화장품, 건강기능식품으로 널리 사용되고 있다.1~2)

카로티노이드는 탄소와 수소로만 이루어진 카로틴과 탄소, 수소 및 산소를 포함하는 잔토필로 구분할 수 있으며3), 하이드록실기(OH)와 카보닐기(C=O)를 모두 갖는 잔토필류 아스타잔틴은 루테인, 지아잔틴 및 베타카로틴(Fig. 1)에 비해 약 10배 이상, 비타민E에 비해 약 500배 이상 강력한 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.4~5) 이러한 항산화 능력은 활성산소(ROS, Reactive oxygen species)를 효과적으로 제거하여 눈의 망막 보호, 항염증 작용, 면역체계 강화, 피부 노화 방지, 심혈관계 질환 예방 등 다양한 분야에서 기능성이 입증되고 있으며,5~6) 암세포의 억제 및 신경질환의 보호제로서 연구에도 활용되고 있다.7~8)



Fig. 1. Chemical structure of carotenoids.
A: Free-astaxanthin, B: Lutein, C: Zeaxanthin, D: β-Carotene

아스타잔틴의 선형 구조를 이루는 여러 개의 이중결합은 cis와 trans 형태의 기하 이성질체를 가질 수 있다. 자연계에 존재하는 아스타잔틴은 all trans 아스타잔틴이 우세하지만, 9-cis, 13-cis 및 15-cis 아스타잔틴도 존재한다(Fig. 2). 아스타잔틴의 원료로 사용되는 헤마토코쿠스 추출물의 구성성분 내에도 이러한 형태의 기하 이성질체가 존재하나 이성질체 간의 약리학적 차이는 크지 않다고 알려져 있다.9~10) 아스타잔틴은 인체 내 합성이 불가능해 외부로부터 공급이 필수적이며, 주로 새우, 게와 같은 갑각류의 껍질이나 효모(Phaffia rhodozyma), 해양생물로부터 추출하여 원료로서 사용한다. 하지만, 갑각류로부터의 추출은 비싼 효소반응과 높은 회분 및 키틴 함량으로 사용이 제한적이고, 효모로부터 추출한 아스타잔틴은 생체이용률이 낮은 3R,3'R 이성질체(Fig. 3)만을 생산하기 때문에 상업적 활용성이 낮다.11) 미세 녹조류(綠藻類, green algae)의 일종인 헤마토코쿠스(Haematococcus pluvialis)는 아스타잔틴의 함량이 약 1.5~3.0%로 갑각류나 해양 생물보다 풍부하여 높은 추출 효율을 보이며, 95% 이상의 아스타잔틴을 에스터 형태로 저장하고 있어 체내에서 비교적 안정성이 높다. 또한, 생체 이용률이 높은 3S,3'S 이성질체를 생산하여 효모의 배양을 통해 생산한 아스타잔틴보다 상업적 활용성이 높다.12) 이에 대한민국 건강기능식품 공전에서는 헤마토코쿠스 추출물을 기능성 원료로 고시하고 있으며, 아스타잔틴으로서 60 mg/g 이상의 함유량을 하한으로 설정하고 있다.13)



Fig. 2. Chemical structure of astaxanthin geometric isomers.
A: all trans astaxanthin, B: 9-cis astaxanthin, C: 13-cis asataxanthin, D: 15-cis astaxanthin



Fig. 3. Chemical structure of astaxanthin stereoisomers.
A: 3S,3’S all trans astaxanthin, B:3R,3’R all trans astaxanthin, C: 3S,3’R(meso) all trans astaxanthin

헤마토코쿠스 추출물 내 아스타잔틴은 주로 하이드록실기(OH) 하나가 에스터화한 monoester 형태로 70~90% 존재하며, 두 개의 하이드록실기가 모두 에스터화한 diester 형태가 5~25%, free 아스타잔틴이 5~10%로 존재한다.14) 따라서 헤마토코쿠스로부터 추출한 아스타잔틴 분석 시에는 cholesterol esterase를 사용하여 에스터기를 제거하는 효소 반응이 필요하다(Fig. 4). 효소는 그 유래에 따라 결과가 다르게 나타나기도 하는데, 일반적으로 카로티노이드에 결합한 에스터기는 Pseudomonas fluorescens 유래 cholesterol esterase를 사용하여 제거한다.15)



Fig. 4. Hydrolysis of astaxanthin diester and astaxanthin monoester to free astaxanthin by cholesterol esterase.

식품의약품안전처는 건강기능식품의 우수한 품질과 효율적인 생산을 위해 건강기능식품 68종에 대한 공전 시험법을 개선해오고 있다. 현재 아스타잔틴에 대한 건강기능식품 공전 시험법(제2023-14호)으로는 제 1법과 제 2법이 수록되어 있으며13), 그중 제 1법은 액체크로마토그래프의 3개의 펌프 시스템을 사용하여 역상칼럼으로 분리한 후 자외선-가시광선 검출기로 아스타잔틴의 최대 흡수 파장(474 nm)을 검출하여 정량하는 방법이다. 하지만 3개 이상의 펌프 시스템을 갖춘 액체크로마토그래프는 실제 건강기능식품을 출시하는 산업체에서 범용적으로 사용되고 있지 않기 때문에 제품 출시를 위한 과정에 어려움이 있을 수 있다.

본 실험에서는, HPLC에서 2개의 펌프 시스템과 역상칼럼을 사용한 분석법을 최적화하여, 아스타잔틴 시험법 제 1법을 개선하고자 한다. 이동상 조건을 최적화하기 위하여 기존의 시험법에 사용되는 이동상 용매 A, B, C의 총량을 계산하고 2개의 이동상으로 통합하였다. 추가로, 시험용액 조제 시 사용되는 cholesterol esterase의 효능을 확인해보기 위하여 cholesterol esterase를 처리하지 않은 시료와 Schizophyllum commune, Pseudomonas fluorescence 유래 cholesterol esterase를 처리한 시료를 비교해보았다.

방 법(Methods)

시약 및 시료

아스타잔틴 표준품(synthetic, 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4'dione, Cas No 7542-45-2, 제품번호 1044200), 내부표준품(trans-β-Apo-8'-carotenal, Cas No 1107-26-2, 제품번호 10810-1G), 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인(Trizma base, Cas No 77-86-1, 제품번호 T1503), cholesterol esterase from Pseudomonas fluorescence(Cas No 9026-00-0, 제품번호 C9281-500UN)는 Sigma Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며 cholesterol esterase from Schizophyllum commune (제품번호 DIA-133)는 Creative Enzymes사(Shirley, New York, USA)에서 구입하였다. HPLC등급의 물(제품번호 4218-88), 메탄올(제품번호 9093-88)은 JT Baker사(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. HPLC등급의 MTBE(Methyl tert-butyl ether, 제품번호 E127)는 Thermo Fisher사(Cleveland, OH, USA)에서 구입하였다. 석유에테르(제품번호 6518-4400), 염산(제품번호 4090-4405), 인산(제품번호 6532-2340)은 대정화금사(Siheung, Korea)에서 구입하였다. 아세톤(제품번호 515), 무수황산나트륨(Cas No 7757-82-6, 제품번호 310)은 덕산종합과학(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 황산나트륨(Cas No 7727-73-3, 제품번호 37279)는 Kanto chemical사(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 증류수는 E LGA사(High Wycombe, Buckinghamshire, England)의 PURELAB Option-Q 기기를 통해 제조하여 사용하였다.

시험용액으로 사용된 시료는 아스타잔틴을 함유한 복합성분으로 15개의 제품을 구입하였으며 모두 연질캡슐 제형이었다.

표준용액의 조제

100 mL 갈색부피플라스크에 아스타잔틴 표준품 10mg을 정확하게 달아 아세톤으로 표선까지 맞춘 것을 표준원액으로 하였다(100 μg/mL).

100 mL 부피플라스크에 내부표준품 10mg을 달아 아세톤으로 표선까지 맞추었다. 이 액을 10mL 갈색부피플라스크에 3.75 mL 취한 후 아세톤으로 표선까지 맞춘 것을 내부표준용액으로 하였다.

10 mL 부피플라스크에 표준원액 5, 2, 1, 0.5, 0.2 및 0.1mL, 내부표준용액 4mL씩을 취한 후 아세톤으로 표선까지 맞춘 것을 검량선 작성용 표준용액으로 하였다(1-50 μg/mL).

시험용액의 조제

모든 조제 과정에서 갈색부피플라스크 또는 차광테이프를 사용하여 빛을 차단하였다.

트리스(하이드록시메틸)아미노메테인 6.057 g을 달아 증류수로 녹였다. pH 7.0이 될 때까지 염산을 넣고 증류수로 1L까지 맞추어 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)을 조제하였다.

Cholesterol esterase (2.35 unit/mg)를 필요한 만큼 취하고 Tris-HCl 용액에 녹여 4 unit/mL cholesterol esterase 용액을 사용 직전에 조제하였다.

100 mL 갈색부피플라스크에 균질화된 시료를 아스타잔틴으로서 약 5~15mg 달아 아세톤으로 녹여 표선까지 맞추었다(50~150 ppm). 이 액을 10mL 갈색부피플라스크에 1 mL 취한 후 아세톤으로 표선까지 맞추어 10배 희석하였다(5~15 ppm). 이 액을 차광테이프를 사용한 원심분리관에 2.5 mL 취하고 내부표준용액 1 mL, cholesterol esterase 용액 2.5mL를 취하여 잘 섞어주었다. 37oC 수욕 상에서 5~15분마다 흔들어주면서 45분간 효소 반응시켰다. 효소 분해 후 황산나트륨 1g과 석유에테르 4mL를 첨가하여 2000 g로 3분간 원심분리하였다. 석유에테르층을 취하여 질소 퍼지로 완전히 건조시켰다. 아세톤 2.5mL로 재조성한 후 초음파 처리하여 용해시켰다. 이 액을 0.2μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.

HPLC 분석조건

액체크로마토그래프는 Waters사(Milford, Massachusetts, USA)의 1525 binary pump system을 사용하였고, 자외선-가시광선 검출기는 Waters사의 2487 dual absorbance detector를 사용하였다. 분석용 칼럼은 Develosil RPAQUEOUS C30 (4.6×250 mm, 5 μm)를 사용하였다. 분리분석을 위해 이동상 용매 A (0.05% 인산이 포함된 물:메탄올=1:9)와 이동상 용매 B (MTBE )의 기울기 농도를 조절하였다. 용리속도는 1.0 mL/min으로 하였고, 이동상의 농도구배는 0-15 min (85% A), 15-23 min (65% A), 23-27 min (20% A), 27-27.1 min (85% A), 27.1-35 min (85% A)로 하였다. 표준용액 및 시험용액의 주입량은 20μL로 하였다. 검출기의 파장은 474 nm로 하였다.

시험법 밸리데이션

HPLC 밸리데이션은 식품의약품안전처에서 공시한 ‘기능성 원료 인정을 위한 제출자료 작성 가이드 [민원인 안내]’에 따라 수행되었으며16) 이는 AOAC법에 근거하였다.17) 특이성은 표준용액과 시험용액의 크로마토그램을 통해 아스타잔틴의 피크 및 인근 물질 피크의 머무름 시간을 비교하여 측정하였다.

크로마토그램의 면적비는 trans 아스타잔틴의 피크면적+(1.3×13-cis 아스타잔틴의 피크면적)+(1.1×9-cis 아스타잔틴의 피크면적) 을 내부표준물질의 피크면적으로 나눈 값으로 하였다. 13-cis 아스타잔틴과 9-cis 아스타잔틴에 곱해주는 상수는 자외선-가시광선 분광기로 측정하여 얻은 13-cis 아스타잔틴과 9-cis 아스타잔틴의 최대흡수파장을 trans 아스타잔틴의 최대흡수파장에 맞추어 계산한 전환계수이다.

직선성은 시험용액에서 검출되는 아스타잔틴의 농도범위를 고려하여 1, 2, 5, 10, 20, 50 µg/mL에 대한 검량선을 작성하였다. 직선성을 3회 반복 측정하여 결정계수(r2) 값이 0.990 이상인지 여부를 확인하였다. 검량선의 기울기(S)와 y절편의 표준편차(σ)에 3.3배를 곱한 값(3.3×σ/S)을 검출한계로, 10배를 곱한 것(10×σ/S)을 정량한계로 설정하였다.

정확도 및 실험실 내 정밀도와 실험실 간 정밀도는 아스타잔틴을 함유하지 않는 복합성분에 아스타잔틴 표준품을 첨가하여 측정하였다. 정확도는 검량선 범위 내 서로 다른 3개의 농도(1, 10, 50 µg/mL)에 대하여 5번 반복 측정하였을 때 회수율이 92~105% 이내로 들어오도록 도출하였다. 실험실 내 정밀도와 실험실 간 정밀도는 검량선 범위 내 서로 다른 3개의 농도(1, 10, 50 µg/mL)에 대하여 5번 반복 측정하였을 때 회수율의 상대표준편차(%RSD)를 계산하여 2% 이내로 들어오도록 도출하였다.

적용성 평가

개선된 시험법이 시중에 유통되고 있는 제품들에 적용가능한지 검토해보았다. 아스타잔틴을 포함하는 복합성분에 대해서 15개의 제품을 검토하였다. 해당 제품들의 크로마토그램을 측정하였고, 얻어낸 면적을 검량선에 대입한 후 제품에 표시되어있는 함량과 비교하여 회수율을 구하였다. 모든 제품의 회수율이 80~120% 이내로 들어왔다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

시험법 최적화

아스타잔틴 시험법 제 1법에서 제공하는 3개의 펌프시스템 이동상 조건을 바탕으로 2개의 펌프시스템에서 시험법을 최적화하였다(Table 1). 이동상 C로 흐르던 1% 인산용액을 이동상 A와 혼합해주기 위해 분석조건동안 흐르는 물과 인산의 양을 계산하였다. 3개의 펌프시스템을 사용하는 이동상 조건에서는 기울기용리를 사용하여 분리해주는 27분의 시간동안 물 1.08mL, 인산 10.8 μL이 소모되었다. 소모된 물과 인산의 총량을 2개의 펌프시스템을 사용하는 기울기용리 조건에 적용하였고 이동상 A를 0.05%인산 메탄올:물(9:1)로 변경함으로써 이동상 조건을 최적화하였다. 최적화된 이동상과 기울기용리 조건으로 분리하는 동안 사용되는 물의 양은 2.035 mL, 인산의 양은 10.175 μL로 이전과 유사하였다.

Gradient conditions of previous method vs modified method
Time (min) Previous mobile phase Modified mobile phase
A B C A* B*
0 81 15 4 85 15
15 66 30 4 70 30
23 16 80 4 20 80
27 16 80 4 20 80
27.1 81 15 4 85 15
35 81 15 4 85 15
Mobile Phase A: Methanol, B: MTBE, C: 1% phosphoric acid
A*: 0.05% phosphoric acid in MeOH:Water (9:1), B*: MTBE


시험용액의 조제 중 사용되는 cholesterol esterase의 효율성을 비교해보기 위해 cholesterol esterase를 처리하지 않은 시료, Schizophyllum commune 유래 효소를 처리한 시료, Pseudomonas fluorescens 유래 효소를 처리한 시료의 크로마토그램을 검토하였다(Fig. 5). 아스타잔틴 제품에 대한 효소 처리의 효율을 확인하기 위하여, 제품에 각 효소를 처리한 시험법을 적용한 결과, cholesterol esterase를 처리하지 않은 시료는 4.31% (±1.43%, n=3), Schizophyllum commune 유래 효소를 처리한 시료는 7.17%(±0.25%, n=3), Pseudomonas fluorescens 유래 효소를 처리한 시료는 86.61% (±7.93%, n=15)의 회수율을 보였다. 따라서 헤마토코쿠스 추출물 내 아스타잔틴 함량시험을 위해서 cholesterol esterase 처리는 필수적이며 Pseudomonas fluorescens 유래 효소의 효율이 가장 높은 것으로 나타났다.



Fig. 5. Chromatogram of test solution.
A: untreated cholesterol esterase, B: treated cholesterol esterase from Schizophyllum commune, C: treated cholesterol esterase from Pseudomonas fluorescens.

밸리데이션 결과

특이성 평가는 아스타잔틴을 포함하지 않는 복합성분을 방해물질로 하여 아스타잔틴 표준품의 크로마토그램을 통해 확인하였다. 방해물질 성분으로는 일반적으로 아스타잔틴과 함께 섭취가 권장되는 성분인 루테인, 베타카로틴, 비타민 A, C, D, E로 구성하였다. 해당 성분들은 UV 파장대에 검출되지 않거나, 목적 성분인 all trans 아스타잔틴, 13-cis 아스타잔틴, 9-cis 아스타잔틴과 피크가 중첩되지 않았다. EP (European pharmacopoeia)에 근거하여 피크 대 골짜기 비율(peak to valley ratio)을 계산하였다. 피크 대 골짜기 비율은 두 개의 피크 사이에 분리가 이루어지지 않았을 때 시스템 적합성 요구 조건으로 사용될 수 있으며, 크로마토그램의 작은 피크의 바탕선으로부터 피크 높이를 크로마토그램의 큰 피크와 작은 피크 사이의 가장 낮은 지점의 피크 높이로 나눈 값이다. 각 데이터에 적용한 결과, trans 아스타잔틴과 11-cis 아스타잔틴의 피크 대 골짜기 비율은 2.5, 11-cis 아스타잔틴과 루테인의 피크 대 골짜기 비율은 3.6으로 충분한 분리능을 가지고 있음을 확인하였다(Fig. 6).



Fig. 6. Chromatogram of standard solution.
A: astaxanthin standard, B: matrix added in astaxanthin standard, C: Magnified view of the chromatogram Fig. 6-B.

직선성은 아스타잔틴 표준품과 내부표준물질을 사용하여 6개의 농도 범위(1~50 µg/mL)에 대해서 검량선을 작성하였으며, 면적비는 9-cis 아스타잔틴과 13-cis 아스타잔틴의 trans아스타잔틴으로의 전환계수를 고려하여 계산하였다. 3회 반복 측정한 결과 결정계수(r2) 값이 1.0000, 0.9999, 1.0000으로 우수하게 나타났다. 3개의 검량선에 대하여 기울기의 평균(S)은 0.05657, y절편의 표준편차(σ)는 0.00040으로 나타났다. 기울기의 평균과 y절편의 표준편차로 계산된 검출한계는 0.023 µg/mL, 정량한계는 0.071 µg/mL로 나타났다(Table 2).

Linearity, limit of detection, and limit of quantitation for astaxanthin analysis
Repetition Slope y-Intercept Regression equation r2
1 0.0567 -0.0056 y=0.0567x-0.0056 1.0000
2 0.0563 -0.0052 y=0.0563x-0.0052 0.9999
3 0.0567 -0.0048 y=0.0567x-0.0048 1.0000
Mean 0.05657 (S) -0.00520 - 0.99997
SD 0.00023 0.00040 (σ) - 0.00006
LOD (3.3×σ/S) 0.023 µg/mL
LOQ (10×σ/S) 0.071 µg/mL


정확도와 정밀도를 측정하기 위해서, 아스타잔틴과 유사한 최대흡수파장을 갖는 루테인을 방해물질로 선정하였고, 아스타잔틴을 포함하지 않는 루테인 복합 성분에 아스타잔틴 표준품을 첨가하였다. 1, 10, 50 µg/mL에 대하여 5번 반복 측정하였고 회수율 범위 93.8~99.7%, 상대표준편차 0.80~1.27%로 모두 적합(AOAC 가이드라인, 10~100 µg/mL기준 회수율 85~110%, 상대표준편차 4% 이내)하여 우수한 정확도와 정밀도를 확인하였다(Table 3).

Accuracy and repeatability results of astaxanthin in the matrix
Repetition Added concentration of Astaxanthin
1 µg/mL 10 µg/mL 50 µg/mL
1 99.6% 95.2% 94.4%
2 98.3% 93.8% 95.6%
3 99.7% 95.4% 97.5%
4 99.8% 95.6% 96.1%
5 98.1% 94.6% 94.6%
Mean recovery rate 99.1% 94.9% 95.6%
Net recovery rate 96.6%
Range of revery rate 93.8~99.7%
SD 1.06% 0.76% 1.22%
%RSD 1.07% 0.80% 1.27%


적용성 검토

개선된 시험법을 적용해보기 위하여 시장에 유통되고 있는 아스타잔틴 15개 제품에 대해서 함량 시험을 실행하였다. 제품 내에는 아스타잔틴과 비슷한 최대흡수파장을 갖는 루테인, 베타카로틴 등 방해물질이 다수 존재하였다(Fig. 7).



Fig. 7. Chromatogram of test solution with matrix including lutein and beta-carotene.

포장지에 표시된 함량을 기준으로 아스타잔틴으로서 8~20 µg/mL 범위로 시험용액을 조제하였다. HPLC로 분석한 후 얻은 크로마토그램의 면적비를 검량선에 대입해본 결과, 표시된 함량에 대하여 80.36~108.13%로 모두 기준에 적합하였다(Table 4).

The contents of astaxanthin in dietary supplements
No Target compound Matrix Stated contents (mg/g) Contents (mg/g) Recovery (%)
1 Astaxanthin Lutein 75.00 66.59 88.79
2 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin D·E 20.00 21.63 108.13
3 Astaxanthin Lutein, Vitamin D·E 3.85 3.26 84.78
4 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin E 20.00 16.80 84.01
5 Astaxanthin Lutein, Vitamin A·E 15.00 12.05 80.36
6 Astaxanthin Lutein, Vitamin A·C·E 15.00 12.72 84.83
7 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin E 12.00 9.77 81.45
8 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin D·E 20.00 16.18 80.90
9 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin D·E 24.00 19.65 81.88
10 Astaxanthin Lutein, Vitamin A·C·E 12.00 9.92 82.63
11 Astaxanthin Lutein 33.67 34.63 102.84
12 Astaxanthin Lutein, β-Carotene, Vitamin E 9.23 7.54 81.63
13 Astaxanthin Lutein, Vitamin E 30.00 24.27 80.91
14 Astaxanthin Lutein, Vitamin A·E 12.00 10.64 88.64
15 Astaxanthin Lutein, Vitamin A·E 13.33 11.65 87.35

결 론(Conclusion)

역상칼럼과 HPLC-UV를 사용하는 아스타잔틴 분석법을 보다 산업적인 범용성을 증진하기 위하여 3개의 펌프시스템에서 2개의 펌프시스템으로 개선하였다. 기존에 사용되는 분석법에서 소모되는 이동상의 양을 계산하여 2개의 펌프시스템에 적용하였고, 크로마토그램을 확인하여 유효성을 검증하였다. 추가적으로, 시험용액의 조제에 사용되는 cholesterol esterase를 비교하여 최적의 효소를 확인하였다. 에스터 결합을 가진 카로티노이드의 분해 작용에 있어 cholesterol esterase의 효소 작용은 중요한 역할을 하는 것으로 보였으며, Pseudomonas fluorescens 유래의 효소를 처리하였을 때 가장 높은 회수율을 보였다. 개선된 시험법의 유효성을 검증하기 위해 AOAC 가이드라인에 기반한 밸리데이션을 진행하였다. 아스타잔틴 표준품을 통해 직선성을 확인하였고 아스타잔틴이 포함되지 않은 방해물질을 첨가하여 특이성, 정확성, 정밀성을 확인하였다. 크로마토그램을 확인하였을 때, 복합제형에 주로 포함되어있는 루테인, 베타카로틴, 비타민과 아스타잔틴의 분리가 명확한 것을 확인하였고 모든 밸리데이션 항목에 대하여 기준에 적합한 결과를 얻었다. 시중에 판매하는 제품을 통한 개선된 시험법의 유효성 검사에서도 만족스러운 회수율을 보였다. 2개의 펌프시스템을 사용한 HPLC 분석법을 최적화하여 다양한 분야에서 보다 범용적으로 활용될 것으로 기대하며 효율적인 cholesterol esterase를 제시하였다는 점에서 연구의 의의가 있다고 사료된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2023년도 식품의약품안전처의 연구개발비(22192미래식046)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

Authors’ Positions

Yooseong Jeong : Graduate student

Junghoon Shin : Graduate student

Yong Seok Choi : Professor

Sang Beom Han : Professor

Dong-Kyu Lee : Professor

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December 2023, 67 (6)
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