메트포르민(Metformin)은 바이구아니드(Biguanide)계열의 혈당강하제로서, 간의 포도당 생합성을 억제하며 말초 포도당 흡수를 증가시켜 고혈당을 개선하여 인슐린 비-의존성 당뇨(Type 2 Diabetes mellitus)의 1차 치료제로서 단독으로 사용되거나 설포닐우레아계, 티아졸리딘계, 디펩티딜 펩티다제-4 (Dipeptidyl peptidase-4) 저해제 등과 병용하여 사용된다. 메트포르민은 높은 수용해도(>300 mg/mL)를 가지지만 낮은 생체이용률을 가지는BCS class III에 속하는 약물로, 혈중 반감기가 5시간으로 짧아 1일 1000~2000 mg을 1일 2~3회로 나눠 복용하거나 서방성 제형을 통해 1일 1회 복용하는 제형으로 경구 투여된다.^1-3)

메트포르민은 경구 투여 시 메스꺼움, 설사, 구토, 팽만감 및복통을 포함하는 위장관 장애가 일반적인 부작용으로 환자의 복약 순응도가 낮은 경우 뇌혈관 질환 발생 위험도와 사망 위험도가 증가할 수 있는 것으로 보고되었다.^4-6)

이러한 이유로 메트포르민 서방성 위 체류 정제 또는 산 부가염을 이용한 용해도 저하 등의 방법으로 일일 복용 횟수를 줄이고 복약 순응도를 개선하고자 하였으나, 경구 투여의 경우 방출 조절 실패로 인한 급격한 약물 방출의 위험성을 가질 수 있어 최근에는 경피 조직이나 점막을 통한 제제가 활발히 연구되어지고 있다.^7-10)

경구 투여를 우회하는 약물 전달 시스템 중 이식형 약물 전달 시스템은 투여 방식에 따라 약물 임플란트(Drug implant)와 이식형 약물 주입 펌프(Implantable drug-loaded pump) 두 가지로 나뉜다. 이중 임플란트는 체내로 약물을 포함하는 제형을 이식하는 제형을 말하며¹¹⁾, 주 1회 내지 연 1회로 투여 빈도가 감소하여 환자의 순응도가 증가하며, 위장관 흡수 및 초회 통과효과를 우회하기 때문에 투여량이 줄어 부작용을 최소화 할 수 있으며, 경구 투여 시 발생 할 수 있는 약력학적 특성을 피할 수 있어 피임, 항정신병 치료, 안구질환, 기타 많은 만성질환 등다양한 분야에 적용되어 왔다.^12-15) 임플란트는 사용되는 서방성 고분자의 종류에 따라 비 생분해성과 생분해성으로 나눌 수 있으며, 생분해성 고분자를 사용한 임플란트는 약물 방출이 종료된 이후 제거할 필요가 없다는 장점을 가지고 있다.¹⁶⁾

생분해성 고분자는 생체 내 또는 자연 환경 하에서 스스로 분해되는 고분자를 말하며 분해 산물이 생체 내에서 완전히 대사,배설 되는 고분자를 생체 내 분해 흡수성 고분자로 분류한다. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)는 lactic acid (LA)와 glycolic acid (GA)의 공중합체로, 체내에서 체액 또는 효소(esterase)에 의하여 가수분해되어 LA와 GA으로 전환되며, 최종적으로 이산화탄소와 물로 체외로 배출된다.¹⁷⁾ PLGA는 LA와 GA의 비율(L:G),말단 작용기의 종류(ester 또는 -COOH)에 따라 생분해 속도와 시간 조절이 가능하여 약물 방출을 장기간 제어할 수 있는 특징을 가지고 있어, 일반적으로 비경구 약물 전달 시스템의 서방성 고분자로 사용되며 생분해성과 생체 적합성을 가져 FDA 승인을 받은 의료용 고분자이다.^18-21)

이러한 임플란트는 고온과 전단력이 필요한 고온 용융압출(Hot-melt extrusion, HME), 용매 주조 또는 압축 성형으로 제조된다.²²⁾ HME는 재료의 융점으로 가열하여 용융시킨 혼합물을 스크류를 통하여 압출하는 기술로 소수성 약물의 용해도와 생체이용률을 높일 수 있으며, 유기 용매나 물을 사용하지 않아 환경 친화적이며, 연속적으로 생산이 가능하여 시간과 비용을 절약하고 약물의 안전성을 보존할 수 있으며, 또한 사용되는 시료의 양을 최소한으로 할 수 있고 고분자에 약물을 결합하여 약물의 전달력을 향상시킬 수 있다.²³⁾

따라서 본 연구에서는 HME로 메트포르민을 함유하는 PLGA-based 임플란트를 제조한 후, 팽윤도와 용출양상을 평가하여 3개월간 지속적으로 방출되는 최적 처방을 개발하고자 하였다.

시약

시약으로는 메트포르민은 Danashmand Organic Pvt. Ltd.사(Mumbai, Maharashtra, India)에서, 저분자 키토산(Low-Chitosan, LCS, MW=50,000-190,000)과 poly-ε-caprylactone (PCL, MW= 40,000)은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서, 알긴산나트륨(Sodium alginate, SA)은 가루나라(Seoul, Korea)에서, 젤라틴은Geltech사(Busan, Korea)에서, 폴리에틸렌글리콜(Polyethyelen glycol, PEG, MW=400, 1,000, 6,000 및 20,000)은 대정사(Siheung, Korea)에서, 폴리에틸렌옥사이드(Polyethylene oxide, PEO, MW=7,000 kDa, PolyoxTM WSR 303 (WSR 303)은Colorcon사(Harleysville, PA, USA)에서, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 시리즈인 Resomer^® RG 502 (RG 502, L:G=50:50, -ester end groups)와 Resomer^® RG 502H (RG 502H, L:G=50:50, -COOH end groups), Resomer^® RG 752H (RG 752H, L:G=75:25, -COOH end groups)는 Evonik사(Darmstadt, Germany)에서, 히드록시프로필셀룰로오스-L (Hydroxy-propyl cellulose-L, HPC-L)은 Nippon-Soda사(Tokyo, Japan)에서그리고 히드록시프로필메칠셀룰로오스(Hydroxypropyl methyl-cellulose, HPMC)는 Whawon사(Hwaseong, Korea)에서 각각 구매하여 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC용 아세토니트릴은 Avantor사(Radnor, PA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 기타시약과 용매는 특급 또는 일급을 사용하였다.

Preliminary study

HME의 압출 조건을 확립하기 위하여 다양한 온도(50~184°C)및 속도(15~50 rpm)에서 용융 압출하여 임플란트의 성상을 관찰하였다.

HME 과정에서 적당한 폴리머와 가소제를 선정하는 것은 약물을 함유하는 임플란트의 안정성과 물리화학적 특성에 영향을미치기 때문에 중요하다.²⁴⁾ 즉, 가소제로서 PEG 400, 1000, 6000및 20000을 전체 중량의 5%로 첨가하여 압출하여 임플란트의성상을 관찰하였다. 또한, Table 1의 처방에 따라 메트포르민을15%로 고정하여 다양한 생분해성 고분자를 단독 또는 혼합하여30 rpm, 각 고분자의 융점 부근에서 압출하여 임플란트의 성상을 육안으로 관찰하였으며, 100 mL의 증류수에서 형태가 유지되는 시간을 관찰하여 평가하였다.

Table 1

Preformulation study of implant containing metformin HCl

#	Composition (w/w%)
	API	LCS	Gelatin	SA	PEG				HPC-L	WSR 303	PCL	HPMC	RG
					400	1000	6000	20000					502	502H	752H
1	15	43	-	-	5	-	-	-	15	22	-	-	-	-	-
2	15	43	-	-	-	5	-	-	15	22	-	-	-	-	-
3	15	43	-	-	-	-	5	-	15	22	-	-	-	-	-
4	15	43	-	-	-	-	-	5	15	22	-	-	-	-	-
5	15	22	-	-	5	-	-	-	15	43	-	-	-	-	-
6	15	43	-	-	5	-	-	-	-	22	-	15	-	-	-
7	15	25	-	-	5	-	-	-	15	35	5	-	-	-	-
8	15	25	-	-	5	-	-	-	-	50	5	-	-	-	-
9	15	-	50	28	7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
10	15	-	60	18	7	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
11	15	-	20	58	-	-	-	-	-	7	-	-	-	-	-
12	15	-	35	35	-	-	-	-	-	5	10	-	-	-	-
13	15	-	45	20	-	-	-	-	-	5	15	-	-	-	-
14	15	-	40	20	-	-	-	-	-	5	20	-	-	-	-
15	15	-	50	20	5	-	-	-	-	-	10	-	-	-	-
16	15	-	50	20	5	-	-	-	-	-	-	-	10	-	-
17	15	-	50	20	5	-	-	-	-	-	-	-	-	10	-
18	15	-	50	20	5	-	-	-	-	-	-	-	-	-	10
19	15	-	-	38	7	-	-	-	-	10	30	-	-	-	-
20	15	-	-	55	7	-	-	-	-	10	-	13	-	-	-
21	15	-	-	38	7	-	-	-	-	10	-	30	-	-	-
22	15	-	-	40	4	-	-	-	-	-	30	11	-	-	-
23	15	-	-	38	7	-	-	-	-	-	40	-	-	-	-
24	15	-	-	28	7	-	-	-	-	-	50	-	-	-	-
25	15	-	-	28	7	-	-	-	-	10	40	-	-	-	-
26	15	-	-	18	7	-	-	-	-	10	50	-	-	-	-
27	15	-	-	46	4	-	-	-	-	15	20	-	-	-	-
28	15	-	-	36	4	-	-	-	-	15	30	-	-	-	-
29	15	-	-	-	4	-	-	-	-	31	-	-	-	50	-
30	15	-	-	-	4	-	-	-	-	21	-	-	-	60	-
30	15	-	-	-	4	-	-	-	-	11	-	-	-	70	-

상호 호환성(Compatibility)

메트포르민과 임플란트에 사용된 고분자인 PLGA (RG 502, RG 502H 및 RG 752H)와 PEO (WSR 303)간의 상호적합성을열 시차열량주사기(DSC N-650, Scinco, Seoul, Korea)와 퓨리에변환 적외선 분광기(FT/IR-4100, Jasco, Tokyo, Japan)를 이용하여 평가하였다.

DSC는 순수 메트포르민, PLGA, PEO, 물리적 혼합물 및 압출된 임플란트를 각각 6mg 취하여 알루미늄 팬에 밀봉한 뒤측정하였다. 이때 고분자 시료의 분해를 막기 위하여 질소 기류하에서 25에서 250°C까지 20°C/min의 속도로 승온시키며 열량의 변화 및 융점을 비교 측정하였다.

FT-IR 스펙트럼은 메트포르민, PLGA, PEO, 물리적 혼합물 및압출된 임플란트를 브롬화칼륨 디스크 정제법을 사용하여 400~4000 cm-1의 범위에서 투광도를 측정하였다.

메트포르민 함유 임플란트의 제조

메트포르민, PEG 400 및 WSR 303을 각각 15, 4 및 11%로고정하고, PLGA (RG 502, RG 502H 및 RG 752H)를 Table 2의 처방에 따라 취하여 유발·유봉으로 10분간 혼합한 후, Haake^TM Mini CTW hot-melt extruder (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, USA)를 이용하여 용융 압출하였다. 이때 스크류 속도와 온도는 30 rpm과 90C이었으며, 2.5 mm multi-die를 사용하였다.이후 상온으로 식힌 뒤, 37.5 mg (메트포르민으로서 5.6 mg 해당량)을 취하여 실험에 사용하였다.

Table 2

Formulation and uniformity of the PLGA-based implant containing metformin HCl

#	Composition (% w/w)						Assay (%)	Diameter (mm)
	API	PEG 400	WSR 303	RG 502	RG 502H	RG 752H
F1	15	4	11	-	70	-	98.97±1.87	2.50±0.00
F2	15	4	11	70	-	-	99.89±1.78	2.50±0.01
F3	15	4	11	65	5	-	101.26±1.91	2.50±0.00
F4	15	4	11	60	10	-	99.33±2.6	2.50±0.01
F5	15	4	11	50	20	-	99.89±2.35	2.50±0.00
F6	15	4	11	-	-	70	101.69±2.84	2.50±0.01
F7	15	4	11	5	-	65	99.07±1.89	2.50±0.01
F8	15	4	11	10	-	60	101.66±1.27	2.50±0.01
F9	15	4	11	15	-	55	99.78±1.48	2.50±0.01

Each value represents of three determinations ± the standard deviations.

균일성 및 함량

압출된 임플란트의 직경은 버니어 캘리퍼스로 측정하여 평가하였다.

압출된 임플란트 100 mg (메트포르민으로서 15mg 해당량)을취하여 증류수 100 mL에서 완전히 용해되도록 교반 및 초음파처리 한 후, 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과하여 증류수를 통해적절히 희석한 액을 검액으로 하였다. 이 때 이동상은 아세토니트릴과 물을 35:65 (V/V%, 0.5% 인산 함유), 컬럼은 Shimpak GIS 5 µm ODS (4.6 mm´150 mm, particle size 5 µm, Shimadzu, Kyoto, Japan), 파장은 271 nm, 유속은 1.0 mL/min 그리고 주입량은 10µL로 하여 HPLC 1260 system (Agilent, Santa Clara, California, USA)에 주입하여 임플란트 내 메트포르민의 함량을분석하였다.

표면특성

제조된 임플라트(처방 F7)의 표면(Apreo 2S, Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, USA)과 단면(S-4800, Hitachi, Schaumburg, IL, USA)을 60mA에서 주사현미경으로 측정하여 결합된 상태를 관찰하였다. 따로 처방 F7을 사용하여 팽윤 현상을 확인하기 위하여 7일과 35일 동안 용출한 검체를 꺼내어 3일 동안 동결 건조(FDU-8606, Operon, Gimpo, Korea)하여 측정하기 전 2주 동안데시케이터에 넣어 건조시켜 수분을 제거한 후, 이온 증착기로백금 코팅하여 표면과 단면을 측정하였다.

In vitro 팽윤도(Swelling ratio)

제조된 임플란트 37.5mg (메트포르민으로서 5.6mg 해당량)을 취하여 인산염 완충액(pH 7.4)에 4mL에 넣어 37.5±0.5°C에서 정해진 시간 간격에 따라 증가된 임플란트의 무게를 측정하여 다음과 같은 식에 의해 팽윤도를 측정하였다.

Swelling%=Ws×WdWd×100

여기에서 W_s는 팽윤된 임플란트의 무게, W_d는 팽윤 전 임플란트의 무게이다.²⁵⁾

In vitro 약물 방출

임플란트의 약물 방출은 초기 급속 방출은 1, 3, 6시간 및 1, 2, 4, 7일 간격으로 확인하였으며, 이후 1주일 간격으로 검액을취하여 장기간 약물 방출을 평가하였다.

즉, 압출된 임플란트 37.5mg (메트포르민으로서 5.6mg 해당량)를 바이알에 취하여 인산염 완충액(pH 7.4) 4.0 mL, 37±0.5°C, 80 rpm으로 진탕배양기(IST-3075R, JeioTech, Daejeon, Korea)를이용하여 진행하였다. 정해진 시간에 따라 검액 4mL를 취한 뒤즉시 동온동량을 보충해주었으며 HPLC로 분석하여 방출률(%)을 구하였다.

용출시험으로부터 얻어진 각각의 데이터는 약물용출 메커니즘에 많이 이용되는 4가지 모델(Zero order kinetic, Higuchi 모델, Korsmeyer-Peppas 모델 및 First order kinetic)을 이용하여 용출속도와의 상관계수를 구하였다. 이때 모델의 용출속도의 상관계수는 다음 식에 의해서 구하였으며, Korsmeyer-Peppas 모델의경우 약물이 10~60% 사이에 용출된 데이터만 사용하여 평가하였다.^26-28)

Zero order kinetic: M_t=K₀×t

Higuchi model: M_t=k_1/2×t_1/2

Korsmeyer-Peppas model: M_t/M_∞=K×tⁿ

First order kinetic: Log M_t=Log M_∞-k/2.303×t

Hixon-Crowell cube root law: M_∞^1/3-M_t^1/3=K^1/3×t

이들 식에서 M_t는 시간 t에서 방출된 약물의 양, M∞은 임플란트에 함유된 약물의 양, K는 속도상수, n은 방출 메커니즘과관련된 지수이다. Korsmeyer-Peppas 모델은 제형의 기하학적 형태에 따라서 조금씩 차이가 있지만, 원기둥 형태의 경우에는n£0.45인 경우 Fickian diffusion release, 0.45<n<0.89인 경우non-Fickian release (anomalous release), n=0.89인 경우 case II transport (Zero order), n>0.89인 경우 super case II transport를따른다고 정의하고 있다.^29-31)

따로 임플란트의 약물 방출 양상을 비교하기 위하여 설정된 모델로부터 T_20%, T_40% 및 T_60%를 산출하여 약물의 방출속도를 평가하였다.

Preliminary study

Table 1과 같이 메트포르민에 각 고분자를 단독 또는 혼합하여 융점 부근에서 압출 여부와 형태 유지시간을 관찰하였다. 즉, LCS는 융점(108°C) 부근 및 그 이상의 온도에서 압출되지 않았으며 특히 180°C 이상에서 HME 내부에서 굳으면서 탄화되는 현상이 발생하여 단독으로는 사용하기에 부적합한 것으로 관찰되었다. 따라서 상대적으로 낮은 온도(60°C)에서 용융되는 가소제인 PEG를 첨가하여 50~60°C에서 진행하였다. 이때 가소제의 양이 4% 이상 포함되어야 경화되거나 부서지지 않았으며, 저분자량인 PEG 400을 사용하는 것이 바람직한 것으로 관찰되어졌다. 또한, LCS에 HPMC, HPC-L, PEO 및 PCL을 일정 비율로 혼합하여 임플란트의 제조 가능성을 확인하였다. 유연성및 서방성을 부여할 수 있는 HPMC를 첨가하였을 때, 10%에서는 유연성 없이 균일하게 압출되어 12시간 정도 형태가 유지되었으나 15% 이상에서는 점도가 높아져서 압출할 수 없었다. HPC-L과 PCL을 혼합하였을 때 유연성은 개선되었으나 쉽게 붕해 되는 것으로 관찰되었고, PEO가 전체 중량의 50% 이상 첨가되면 형태 유지 및 서방성은 증가하였으나 압출과정에서 부푸는 현상이 나타나 균일한 직경으로 제조하기 어려웠다.

따라서 LCS 이외에 유리 전이온도가 낮은 젤라틴을 90°C에서 압출하였을 때 10~20%의 수분을 넣고 기기 내부 순환 과정을 통한 균질화 과정이 필요하였고, 비율이 증가할수록 최대 24시간 동안 방출 지연 효과가 있었다. SA는 젤라틴과 달리 따로 수분을 넣어주는 과정이 없어도 비교적 균일하게 얻을 수 있었지만 60% 이상 첨가되면 점도가 높아지면서 기기 작동이 불가능하였다. 메트포르민 15%, SA 18~55%, PEG 4~7%, PEO 10~15% 및 PCL 20~50% 중량 비율로 변경하면서 방출률을 검토하였을 때 SA 30% 이상에서는 방출 조절이 되었으나 그 이하에서는 SA 이외에 다른 요인 즉, PCL에 의해 방출이 조절되는 것으로 나타났다. SA는 2일 동안 85% 이상의 약물이 방출되면서 지연되었지만 7일 이상의 방출에는 적합하지 않았다. 방출 지연효과가 있다고 알려진 PLGA를 70% 이상 사용했을 때, 균일하고 유연한 압출물을 얻을 수 있었으며 다른 고분자들보다 7일 이상 방출 지연 효과가 있는 것으로 관찰되었다.

따라서 이하 연구에서는 폴리머로 PLGA와 PEO를, 가소제로PEG 400을 이용하여 30rpm, 90C에서 임플란트를 제조하였다.

상호 호환성

메트포르민, PLGA (RG 502, RG 502H 및 RG 752H), PEO, 물리적 혼합물 및 임플란트를 DSC로 분석하여 물리적 상태를 결정하였다. 메트포르민은 235°C (228~245°C)의 강한 흡열 피크를, PLGA는 종류와 무관하게 40~50°C의 넓고 약한 흡열 피크를, 그리고 PEO는 73°C (60~81°C)에서 흡열 피크가 나타났다. 물리적 혼합물에서 PLGA와 PEO의 피크가 각각 42 (40~50°C)와 67°C(60~70°C)에서 개별적으로 나타났으나, 임플란트에서는 합쳐져서 60°C (40~65°C)에서 단일 피크로 그리고 메트포르민은 각각 233 (226~243°C)과 229°C (220~238°C)로 약간 이동하여 나타났다(Fig. 1(a)). 이는 Fan 등³²⁾의 연구에서와 동일하게 용융 압출과정에서 PLGA와 PEO가 용융되며 공융혼합물이 되어 흡열 범위가 넓어진 것으로 보이며, 메트포르민의 경우 용융된 고분자에 부분적으로 용해되어 흡열 피크가 앞당겨지고 넓어진 것으로 사료된다.

Fig. 1. DSC chromatogram (a) and FT-IR spectra (b) of pure meformin HCl (A), RG 502 (B), RG 502H (C), RG 752H (D), WSR 303 (E), physical mixture (F), and implant (G).

FT-IR 분석 결과 물리적 혼합물과 임플란트의 스펙트럼에서 모두 메트포르민의 특징적 작용기인 1차 아민(R-NH2)기의 stretching 피크가 3370와 3294 cm^-1 에서, bending 피크가 1625 cm^-1에서, 1차 케티민(R₁C (=NH)R₂)기의 (C=N)의 피크가 1568 cm^-1에서, 2차 아민(R₁-NH-R₂)기의 (C-N)의 bending 피크가 1583 cm^-1에서, 3차 아민(-R₃N)기의 (C-N)의 신축 진동이 1166cm^-1에서 그리고 -메틸(R-CH₃)기의 (C-H)의 피크가 1448, 1475 및 1417 cm 1에서추가적인 결합 없이 관찰되어 물리적 및 화학적 상호작용 없이 양호한 상호 호환성을 나타내었다(Fig. 1(b)).

표면 및 균일성

PLGA를 사용하여 제조된 임플란트는 흰색으로 98.97~101.69%의 약물 함량을 나타냈으며, 2.50±0.01 mm 두께로 균일하게 제조되었음을 확인하였다(Table 2).

제조된 임플란트의 표면을 SEM으로 측정하였을 때 모두 표면은 기공이나 결정의 형태 없이 균일하고 매끈한 표면이 관찰되어 균일한 형태로 제조되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 2. SEM pictures on surfaces and cross section of metformin HCl loaded implant in formulation F7 before and after for exposure 7 days and 35 days to phosphate buffer solution (pH 7.4).

In vitro 팽윤도

제형의 수화능력은 팽윤도와 약물 용출속도에 있어서 중요한인자 중의 하나이다.³³⁾ 일반적으로 임플란트의 고분자 매트릭스내로 물이 침투됨에 따라 표면의 고분자부터 수화되어 고분자 얽힘이 풀려 팽윤되어 겔 층을 형성하며, 친수성이 높을수록 물의 침투가 용이하여 겔 층의 두께가 증가하여 팽윤도가 증가하게 된다. 이 때 고분자 매트릭스의 중심부는 고분자가 강하게 얽혀 있어 높은 점도와 저항력을 가지게 되어 매트릭스 내 약물의 용출을 저해하며, 매트릭스 중심부에서 멀어질수록 고분자겔 층은 점진적으로 수화되어 고분자 사슬이 풀리고 용해되면서 점도가 낮아져 약물이 방출될 수 있게 된다.

특히 PLGA와 같은 생분해성 고분자의 경우 침투된 물 또는 효소에 의하여 고분자 사슬의 외부로부터 가수분해가 일어나 사슬의 길이가 짧아지며 물의 침투가 용이하게 되어 수화된 고분자 겔의 점도가 낮아지며 짧아진 고분자 단량체는 물에 용해되어 그로 인한 침식이 일어나 약물이 방출되도록 한다.^34-36) 따라서 본 연구에 사용한 PLGA의 LA와 GA 비율과 말단의 차이 및 분자량에 따른 팽윤도의 차이는 약물의 용출에도 영향을 미칠 것으로 사료된다.

제조된 RG 502와 RG 752-based 임플란트의 시간에 따른 팽윤도와 특징을 Fig. 3과 Table 2에 각각 나타내었다. Fig. 3에서보는 바와 같이 RG 502와 502H를 70% 첨가했을 때 초기 4일동안의 팽윤도는 비슷하였으나 7일 후부터 급격하게 증가하여14일 후에 각각 543.9±108.9%와 1106.31±154.62%의 최대 팽윤도를 나타내면서 49일과 56일 후에 완전히 분해되었다. 이러한 현상은 ester 말단 작용기보다 친수성이 강한 -COOH 말단 작용기에서 물의 침투가 빠르게 일어나지만, 동시에 부분적으로 매트릭스 내의 pH를 감소시켜 가수분해가 촉진되어 침식이 일어나면서 상대적으로 낮은 팽윤도와 유지시간을 나타낸 것으로 사료된다. RG 502에 RG 502H를 5와 10% 첨가한 경우 매트릭스내부의 pH를 낮추어 가수분해를 촉진시켜 팽윤과 동시에 침식을 수반하면서 RG 502 단독보다 낮은 928.1±20.3%와 886.0± 21.6%의 팽윤도를 보여주는 결과에서도 확인할 수 있었다.

Fig. 3. Swelling ratio of RG 502-based (a) and RG 752H-based (b) implants containing metformin HCl in phophate buffer solution (pH 7.4). On the right side, zooms on early points are shown. In the formulation F6, swelling ratio was evaluated at one point (14 days).

일반적으로 LA와 GA의 블록 공중합체인 PLGA는 구조적으로 GA와 유사하나 methyl기로 인해 소수성이 강한 LA의 비율이 증가할수록 매트릭스 내로 물의 침투가 저해되어 팽윤도가 감소하며, 가수분해의 속도가 늦추어질 수 있으므로 더 긴 형태유지시간을 가지게 되는 것으로 알려져 있다.³⁷⁾ 즉, LA를 높은 비율로 함유하는 RG 752H를 70% 함유했을 때 592.0±102.1%로 RG 502H와 유사하게 낮은 팽윤도를 나타내었으나 최대 팽윤시간이 42일로 지연되면서 98일 후에 완전히 분해되었다. 또한, RG 752H에 RG 502를 5, 10 및 15% 첨가하여 친수성을 증가시킨 처방 F7, F8 및 F9의 시간에 따른 팽윤도를 측정하였을때 처방 F7과 F8에서 최대 팽윤도가 42일 후에 각각 1129.1± 97.7과 1088.75±116.26%로 두 배 이상 증가하면서 91일과 84일간 형태가 유지되었으나, 15% 첨가한 처방 F9에서는 최대 팽윤도가 21일 후에 864.9±148.4%의 낮아지면서 63일 후에 완전히 분해되어지는 현상을 확인할 수 있었다.

처방 F7를 용출 0, 7 및 35일 후에 동결건조하여 수분의 함량을 측정하였을 때 각각 85.50과 97.79%로서 팽윤된 무게를 처음 무게와 비교하여 측정한 83.90±0.6과 80.1±3.7%와 약간 차이가 발생하였는데 이는 최대 팽윤도에 도달한 이후 가수분해로 인하여 침식이 급격하게 일어나 임플란트의 무게는 실제적으로 감소되지만 전체적인 팽윤은 계속 이루어지면서 부피가 증가되기 때문인 것으로 사료된다(Fig. 4). 이러한 현상은 임플란트의 가수분해가 중심부에서 보다 표면에서 더 빠르게 진행되면서 여러 크기의 많은 기공이 관찰되는 7일 후의 SEM 측정에서 알 수 있듯이 고분자 수화 겔의 점도로 인해 물의 침투가 저해되어 표면에서의 침식이 일어난다는 것을 시사해주는 결과라 할 수 있다. 최대 팽윤도에 도달한 이후에도 생분해가 지속적으로 일어나 겔의 강도가 약해져 결국 가수분해로 인해 생성된 작은 크기의 기공을 가지는 파편으로 분해되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).

Fig. 4. Pictures of implants before and after exposure to phosphate buffer solution (pH 7.4) for different time periods. In the formulation F7 and F9, the implants became too fragile to be handle after 70 and 63 days, respectively.

이상의 결과에서와 같이 PLGA의 유형별 특징에 따라 발생되는 임플란트의 수화능력 차이는 용출에도 영향을 미칠 수 있을것으로 기대되어진다.

In vitro 용출

PLGA는 70% 이하에서는 3일 안에 90% 이상 약물이 방출되면서 용출량을 조절할 수 없었으나 70% 이상을 함유하는 경우에는 종류에 따라 최소 49일에서 최대 98일까지 약물이 지속적으로 방출되는 양상을 나타내었다(data not shown). 이는 친수성 약물인 메트포르민이 초기에 빠르게 방출되기 때문에 충분한 두께의 팽윤된 폴리머 겔을 함유해야 하기 때문인 것으로사료된다.

Fig. 5와 Table 3에 PLGA-based 임플란트로부터 메트포르민의 방출 양상을 각각 나타내었다. 팽윤도와 동일하게 PLGA 고분자 겔의 팽윤 및 침식 특성 즉, PLGA 말단 작용기의 종류 및LA와 GA의 비율 그리고 분자량에 따른 영향으로 설명할 수 있다. 즉, ester 말단 작용기보다는 –COOH 말단 작용기에서 그리고 GA의 비율이 증가할수록 용출률이 증가되었다.^37,38)

Table 3

Summary of release rate and swelling characteristics of PLGA-based implant containing metformin HCl

#	Total release duration (Days)	Mean release rate (mg/L/day)	Burst release amount (mg)	Peak release rate (mg/L/day)	Time of peak released rate (Days)	Peak swelling ratio (%)	Time of peak swelling ratio (Days)	Dissolution rate (%) at time of peak swelling ratio
F1	49	0.14±0.01	0.77±0.16	0.32±0.02	14	543.88±108.91	14	63.81±3.10
F2	56	0.12±0.01	1.77±0.09	0.17±0.03	42	1106.31±154.62	14	37.11±4.29
F3	56	0.13±0.02	0.82±0.17	0.33±0.09	35	928.08±20.300	14	24.80±2.81
F4	56	0.12±0.01	1.26±0.33	0.20±0.02	28	885.98±216.55	14	36.85±3.82
F5	56	0.15±0.02	3.33±0.22	0.18±0.04	28	654.70±113.19	14	56.29±3.93
F6	98	0.08±0.01	0.79±0.08	0.34±0.08	7	591.95±102.11	42	77.01±1.52
F7	91	0.11±0.02	0.62±0.12	0.17±0.03	21	1129.14±97.680	42	59.34±6.82
F8	84	0.08±0.01	0.43±0.08	0.15±0.01	21	1088.75±116.31	42	66.03±2.24
F9	63	0.16±0.02	2.37±0.71	0.28±0.00	21	864.94±148.42	21	58.51±2.01

Each value represents of three determinations±the standard deviations.

Fig. 5. Dissolution rate (%) of RG 502-based (a) and RG 752H-based (b) implants containing metformin HCl in phosphate buffer solution (pH 7.4) at different time intervals (Mean±SD, n=3). On the right side, zooms on early points are shown.

처방 F1, F2 및 F6에서 14일 후의 용출률은 각각 37.1±4.3, 63.8±3.1 및 50.9±1.5%를 보이면서 -COOH 말단 작용기를 가지면서 GA의 비율이 높을수록 그리고 분자량이 낮을수록 용출률이 높아지는 결과를 얻을 수 있었으며 특히 LA 비율이 높은RG 752H의 방출양상은 상대적으로 투과되는 물의 양이 적어 약물 방출 초기에는 팽윤보다는 침식으로 인해 충분히 두꺼운 고분자 겔이 형성되지 않아 높은 방출률을 보이다가, 침투된 물의 확산으로 최대 팽윤도에 도달하면서 고분자 겔 층의 두께가 증가하며 방출이 지연되고, 이후 가수분해가 진행되며 방출이 가속화된다는 기존 문헌의 결과와 동일한 것이라 할 수 있다.³⁹⁾

PLGA를 70%로 고정하여 ester 말단 작용기를 가지는 RG 502에서 RG 502H의 비율이 증가할수록 최대 팽윤 시간은 변화하지 않았으나 용출률은 증가하여 20% 함유하였을 때 RG 502H 70% 함유한 처방과 유사하게 56.3±3.9%로 나타났다. 증가되는 용출률은 RG 502H가 증가될수록 친수성의 경향이 더 강해지며 침투된 물이 임플란트 내로 빠르게 확산되어 가수분해가 촉진되면서 감소된 pH에 의해 분해를 촉진시키기 때문인 것으로 사료된다.⁴⁰⁾

또한, RG 752H에 ester 말단 작용기를 가지는 RG 502를 첨가하였을 때 초기 용출률은 크게 감소되어 특히 5%를 함유하는 처방 F7에서는 91일 동안 지속적으로 방출되는 양상을 나타내었다. RG 502의 비율이 증가하면서 침투되는 물의 양이 증가하면서 RG 752H의 -COOH 말단 작용기와 상호작용하여 침식을 촉진시키면서 방출기간이 짧아져 처방 F9에서는 70일 후에 방출이 종료되었다. 또한, 제조된 모든 처방에서 메트포르민은 49~98일 동안 0.08~0.16 mg/L/day의 평균속도로 치료 범위(0.0645~0.645 mg/L) 내에서 방출되었으며, 급속 방출은 0.43~3.33 mg/L이, 이후 최대 0.15~0.33 mg/L/day로 용출되어 젖산증을 유발할 수 있는 2.5 mg/L 이하의 안전한 농도로 지속적으로 방출되었다(Table 3).^1,41)

이상의 연구결과를 바탕으로 RG 752H에 RG 502를 5~10%혼합하면 초기 급속 방출 없이 일정기간 동안 diffusion-controlled방출을 나타낼 수 있는 최적의 임플란트를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

상관관계 및 용출 메커니즘

임플란트의 팽윤도가 용출에 미치는 영향을 최대 팽윤도 전과 후로 나누어 분석하여 Table 4와 Fig. 6에 각각 나타내었다. 즉, 모든 처방에서 Pearson 상관계수가 0.89 이상으로 팽윤도는 용출에 영향을 주는 것으로 나타났고, RG 502-based 임플란트는 초기에 팽윤속도보다 침식속도가 더 크게 나타났으나 RG 752H-based 임플란트는 최대 팽윤도에 도달하는 시간이 길어지며. 용출률에 대한 팽윤 속도가 크게 증가하였고, 침식 속도는 훨씬 감소하여 지속적으로 방출되는 양상을 나타내었다.

Table 4

Pearson correlation analysis of PLGA-based implant containing metformin HCl

#	To peak swelling		After peak swelling
	Pearson coefficient (p-value)	Equation (R2)	Pearson coefficient (p-value)	Equation (R2)
F1	0.9764 (0.000)	y=0.127x–7.546 (0.9534)	-0.8961 (0.016)	y= -0.038x+83.991 (0.8030)
F2	0.6980 (0.037)	y=0.022x+17.169 (0.4872)	-0.9016 (0.006)	y= -0.051x+83.152 (0.8128)
F3	0.9267 (0.000)	y=0.022x+5.789 (0.8587)	-0.9258 (0.003)	y= -0.077x+83.027 (0.8570)
F4	0.9702 (0.000)	y=0.035x+4.357 (0.9412)	-0.9681 (0.000)	y= -0.065x+93.866 (0.9372)
F6	0.9322 (0.000)	y=0.165x–6.584 (0.8690)	-0.9404 (0.000)	y= -0.032x+92.464 (0.8844)
F7	0.9910 (0.000)	y=0.058x–3.592 (0.9821)	-0.9862 (0.000)	y= -0.033x+95.210 (0.9726)
F8	0.9656 (0.000)	y=0.071x–3.107 (0.9324)	-0.8937 (0.007)	y= -0.026x+90.31 (0.7987)
F9	0.9665 (0.000)	y=0.055x+7.006 (0.9341)	-0.9174 (0.001)	y= -0.039x+96.779 (0.8416)

Fig. 6. Pearson correlation analysis on to before (a) and after (b) peak swelling ratio of metformin HCl loaded implant in phosphate buffer solution (pH 7.4).

용출 메커니즘을 살펴보았을 때, RG 502-based 임플란트는 R² 값이 ~0.9 이상으로서 First order kinetic으로 조절되면서 약물농도에 의존하여 방출하여 초기 급속 방출이 나타났다. 그러나LA의 비율이 높은 RG 752H는 R²값이 0.6418로 낮았으나 RG 502의 비율이 증가하면서 R²값이 증가하면서 초기 급속 방출이 높아지는 경향을 나타내었다(Table 5).

Table 5

Regression coefficient (R²⁾ values of metformin HCl release data obtained from implant

	Zero order	First order	Higuchi model	Hixson-Crowel	Korsmeyer-Peppas model			Days
					R2	k	n	T20%	T40%	T60%
F1	0.8849	0.7470	0.9689	0.9459	0.9817	13.46	0.4133	4*(2.61**)	11(13.9)	14(37.2)	Fickian
F2	0.9482	0.9272	0.9187	0.9297	0.9634	26.03	0.1792	0.13(0.23)	21(11.0)	28(105.6)	Fickian
F3	0.9742	0.9475	0.8972	0.8791	0.9694	11.25	0.3589	7(4.97)	28(34.2)	35(105.8)	Fickian
F4	0.9742	0.8991	0.9584	0.9544	0.9830	18.15	0.2628	2(1.45)	21(20.2)	28(94.7)	Fickian
F5	0.7710	0.8013	0.8830	0.8882	0.9957	39.98	0.1388	0.04(0.01)	1(1.0)	17(18.6)	Fickian
F6	0.8506	0.6418	0.9732	0.9461	0.9940	11.95	0.5408	4(2.59)	7(9.3)	21(19.8)	non-Fickian
F7	0.9837	0.7284	0.9828	0.9365	0.9968	4.61	0.6794	7(8.68)	28(24.1)	42(43.7)	non-Fickian
F8	0.9764	0.7868	0.9810	0.9805	0.9908	4.42	0.7138	7(8.28)	21(21.9)	35(38.6)	non-Fickian
F9	0.9070	0.7477	0.9819	0.9518	0.9884	18.36	0.3526	2(1.28)	14(9.1)	21(28.8)	Fickian

* is actual data ** is calculated data.

T_x% is the for X% release (T_x%) from metformin HCl loaded subcutaneous implant.

RG 502-based 임플란트는 Zero order에 fitting했을 때 R²값이0.9689로 가장 적합하였으며, RG 502H가 5와 10%에서는 0.9742로 증가하다 20%에서는 0.7710으로 감소되었으나 Hixson-Crowel모델과 Higuch 모델에서는 0.88로서 더 적합하였다. RG 752H-based 임플란트에서는 Higuchi 모델에서 R²=0.9732로 가장 적합하였고, RG 502가 5와 10%로 증가함에 따라 Zero order와 Highuchi 모델에서 0.98 이상으로 적합한 것으로 분석되었다.

Higuchi 모델에 적용하였을 때 모든 처방의 R²값은 ~0.9 이상으로 좋은 상관성을 나타내어 Korsmeyer-Peppas 모델에서 가장적합한 것으로 나타났다(R²=0.9634~0.9968). n값(방출 지수)은0.14~0.71로 확산과 침식을 통한 anomalous (non-Fickian) diffusion mechanism (처방 F6, F7 및 F8) 또는 Fickian release (처방 F1, F2, F3, F4, F5 및 F9)의 형태로 나타나서 시간대별 용출 양상을 뒷받침해주는 결과를 얻을 수 있었다.

이와 같이 RG 502를 주 고분자로 사용하였을 때 Fickian 방출이 나타나는 현상은 팽윤 결과와 동일하게 초기 고분자 매트릭스 내에 물이 침투되면서 친수성 약물인 메트포르민이 용해되어 급속 방출이 나타나며 이후 급격하게 팽윤됨에 따라 고분자 수화 겔의 두께가 빠르게 두꺼워지며 약물 방출 속도가 급격히 감소하며, 최대 팽윤도에 도달한 이후 침식 및 생분해되며 겔의 두께가 얇아지며 매트릭스 내 약물 방출 속도가 다시 증가되는 것으로 볼 수 있다.⁴²⁾

이와는 달리, RG 752H를 주 고분자로 사용하였을 때 RG 502 15%를 함유한 처방 F9를 제외하고는 처방에서는 non-Fickian release의 형태로 나타났다. 이는 RG 752H의 경우 RG 502나RG 502H보다 고분자의 친수성이 낮아 물의 침투가 줄어들어 메트포르민이 상대적으로 적게 용해되어 급속 방출이 감소되었으며, RG 752H 단독(처방 F6)으로 사용하였을 때 고분자 매트릭스가 수화됨에 따라 고분자 수화 겔의 두께가 두꺼워짐과 함께 약물 방출이 지연되는 현상과 달리 상대적 친수성 고분자인RG 502를 추가하면 매트릭스 내 물의 침투가 증가하여 최대 팽윤도가 증가하면서, 이로 인하여 생분해 및 침식 또한 빠르게 일어남에 따라 약물의 방출 속도가 유지되며 지속적으로 방출되는 것이라 할 수 있다.

이러한 점은 처방 F9와 비교하였을 때, 친수성 고분자의 양의 증가하여 초기 매트릭스 내 침투되는 물의 양이 증가하여 급속 방출이 나타나며, 최대 팽윤도에 더 빠르게 도달하였으며 팽윤과 침식이 동시에 일어나 최대 팽윤도가 더 낮게 나타나는 것을 통해 확인할 수 있었다.⁴³⁾

이러한 용출 메커니즘 결과는 RG 502-based 임플란트에서502H가 증가할수록 겔 층의 팽윤과 함께 침식이 일어나 약물의 방출 속도가 유지되며, 20%에서는 겔 층의 팽윤보다 침투된 물에 용해된 약물의 용출 및 가수분해로 인해 초기의 높은 급속방출이 나타나다가 약물 방출이 가속화되는 것이며, RG 752H-based 임플란트에서 502가 늘어날수록 겔의 팽윤도에 비하여 용출률이 감소하여 약물의 방출이 저해되어진다는 용출과 팽윤의 결과를 확인할 수 있는 것으로 사료된다.

PLGA를 방출 조절제로 사용하여 HME를 이용하여 메트포르민을 함유하는 임플란트를 제조한 후, 팽윤도와 용출 양상을 평가하여 3개월간 지속적으로 방출되는 최적 처방을 개발하고자 하였다. 메트포르민을 함유하는 임플란트는 PEO, PEG 및 PLGA의 영향을 받지 않고 30 rpm, 90°C에서 HME로 균일하게 제조되었다. 팽윤도와 용출률은 PLGA 내 LA와 GA의 비율 및 말단의 종류에 따라 영향을 받아 -COOH의 말단 작용기와 GA의비율이 높을수록 용출률은 증가하였고 최대 팽윤도 및 도달시간은 LA의 비율이 높을수록 증가되면서 오래 유지되었다. 제조된 임플란트는 Korsmeyer-Peppas 모델에 따라 0.14~0.71의 n값을 가지면서 확산과 침식을 통한 anomalous (non-Fickian) 또는Fickian diffusion mechanism으로 방출되었다. 따라서 본 연구에서는 RG 752H에 RG 502를 5~10% 혼합하면 초기 급속 방출없이 일정 기간 동안 diffusion-controlled release를 나타낼 수 있는 최적의 임플란트를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

이 논문은 2022년도 정부(산업통상자원부)의 재원으로 한국산업기술진흥원의 ‘바이오융복합기술 전문인력 양성사업’의 지원을 받아 수행된 연구임(No. P0017805).

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.