골다공증은 뼈를 약화시켜 외부로부터의 갑작스러운 충격에 의해 예상치 못한 골절이 발생할 위험성이 높아지게 한다. 이질병은 증상이나 통증 없이 진행되어 고관절, 손목 및 척추에 골절이 발생하기도 하며, 특별한 진단을 받지 않는다면 뼈가 골절될 때까지 발견되지 않을 수 있으나 예방이나 치료를 위한 다양한 치료법이 알려져 있다.¹⁾ 골다공증은 남성과 여성 모두에게 발생하지만, 여성은 남성보다 질병에 걸릴 확률이 4배나 더 높다. 50세 이후의 여성 50%, 남성 25%가 일생 동안 골다공증 관련 골절을 경험하게 되고, 골절을 경험하지 않은 사람 중 대략30% 정도의 사람들은 골감소증을 보여 골밀도가 낮으므로 골다공증에 의한 골절의 발병 위험이 높다. 대한민국 또한 점진적으로 고령화 사회로 접어들면서 매년 골다공증에 의한 골절의 빈도는 증가하고 있으므로 이를 예방하고 치료할 수 있는 연구에 대한 요구가 높아지고 있는 실정이다.

뼈는 신체를 지탱하고 중요한 장기를 보호하며 칼슘과 다양한 미네랄을 저장한다. 현재까지 골다공증이 발병하는 정확한원인은 불분명하지만 어떻게 발병하는지에 대한 메커니즘은 알려져 있다. 뼈는 살아있고 성장하는 조직으로 이루어져 있어서 건강한 뼈의 내부에는 스펀지처럼 보이는 소주골이라는 부분이 존재한다. 골다공증이 발생하면 소주골의 밀도가 낮아져서 스펀지 형태의 조직으로 구멍이 커지게 되어 뼈의 내부가 약해진다.뼈는 손상된 조직을 제거하고 새로운 건강한 조직으로 대체하는 리모델링 과정을 수행하면서 항상성을 유지한다. 대략 30세전까지는 일반적으로 손실되는 것보다 더 많은 뼈를 생성하며, 그 이후에는 뼈의 붕괴가 뼈의 형성보다 더 빨리 일어나서 점진적으로 뼈의 질량이 감소하는 경향을 보인다. 골다공증 환자의 경우 정상인보다 더 빠른 속도로 골량이 감소하며, 특히 여성의 경우 폐경기 이후 뼈가 파괴되는 속도가 훨씬 더 빨라진다. 골 리모델링은 파골세포와 조골세포 활동에 의해 매개되는 골재형성 과정으로 건강한 신체에서도 평생에 걸쳐서 지속된다.그러나 파골세포와 조골세포의 항상성에 문제가 생김으로서 골다공증이 발생하게 된다.²⁾ 골다공증의 기전 관련 연구에 의해 골재형성에서 osteoprotegerin/receptor activator of Nuclear factor-κB 리간드(OPG/RANKL)로 구성된 분자가 파골세포와 조골세포사이의 중요한 결합 요소로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 조골세포 또는 골수 기질 세포에서 생성되는 OPG는 RANK에 대해 RANKL과 서로 경쟁적으로 결합하여 RANKL에 의한 파골세포생성 및 분화를 억제하는 역할을 한다. RANKL 등에 의해 분화가 촉진된 파골세포는 분화가 진행되면서 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 양성 다핵세포(TRAP-positive MNCs)로 변형되어 건강하지 않은 골 조직을 제거하는 골흡수의 역할을 수행한다.³⁾

파골세포의 분화는 중요한 사이토카인인 macrophage colony stimulating factor (M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor-κB (NF-κB) ligand (RANKL)에 의해 조절된다.⁴⁾ M-CSF와 RANKL에 의하여 유발되는 파골세포 분화 과정 중에 NFATc1 발현과관련 유전자의 발현을 조절하여 파골세포의 분화가 야기된다.⁵⁾ 사이토카인 RANKL이 RANK에 결합하는 상호반응에 의해 파골세포의 분화과정에서 mitogen-activated protein kinase (MAPK)및 NFATc1의 활성화가 유도된다.^6-8) NFATc1은 파골세포 형성의핵심 전사 인자로서 TRAP, cathepsin K (CTSK), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP)과 같은 파골세포 분화 및 활성화 인자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.^9-14)

리그난(lignan)은 많은 식물 종의 뿌리, 줄기, 나무껍질, 열매 및 씨앗에서 발견되며 측쇄의 중심 탄소에서 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 단위의 이량체화에서 파생되며, 다양한 구조와 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 이 중 식물에서 추출한 천연 디벤질부티로락톤(dibenzylbutyrolactone) 리그난은 항산화, 항염, 항바이러스, 항암, 이뇨, 포스포디에스테라제 저해,신경 보호, 식물성 에스트로겐, 항혈소판 응집 활성을 보인다고 알려져 있다.¹⁶⁾ 본 연구에 사용된 savinin은 Chamaecyparis obtusa의 잎으로부터 분리되었으며, 이 물질이 항종양, 항염, 항바이러스와 같은 약리학적 성질을 가지고 있는 것으로 발표되었다.

본 연구에서는 savinin의 신규 생체 활성에 대한 연구가 수행되어, 골다공증을 예방하고 치료할 수 있는 소재를 발굴하기 위한 연구로 savinin의 파골세포 분화 억제 효과에 대한 메커니즘을 확인하였고 이를 이용하여 향후 건강기능식품이나 의약품으로 개발 가능할 것으로 기대되는 소재를 발굴할 수 있었다.

식물 재료

C. obtusa는 전라남도 광양시 백운산과 서울 남부 숲에서 채집하였고, 표본(SCNUP004-L)은 순천대학교 약학대학 약학연구소에 기탁되었다.

추출 및 분리

건조된 C. obtusa 잎(1.9 kg)을 실온에서 초음파 처리하여 메탄올(3 h×3)로 추출했다. 잔류물을 진공에서 농축하여 조 추출물(336.5 g)을 얻은 후 H₂O에 현탁시키고 n-헥산, CHCl3, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 H₂O에 분배하여 각각 73.1, 26.7, 54.0, 100.0 및 62.7g의 잔류물을 얻었다. 이들 분획 중 에틸 아세테이트 분획을 CHCl3-CH3OH의 농도구배를 이용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 15개의 분획을 얻었고, 이 중 용출분획 1번인 분획물(76.8 mg)을 Sephadex LH-20 (CH3OH) 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리하여 단일 화학물질을 분리하여 구조 분석한 결과 savinin임을 확인하였다. 본 연구에 사용된savinin의 구조식은 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1. The chemical structure of savinin.

대식세포 제작 및 in vitro 파골세포 억제 활성 실험

본 연구에서 사용한 대식세포(Bone marrow macrophages; BMMs)는 5주령 수컷 ICR 마우스의 대퇴골과 경골을 분리하여 아래의 과정에 의하여 제작되었다. 마우스 대퇴골과 경골에서 분리된 Bone marrow cells (BMCs)를 10% Fetal bovine serum (FBS; Invitrogen Life Technologies, CA, USA)과 100U/mL penicillin/streptomycin이 포함된 α-MEM (10% α-MEM) 배지에서10 ng/mL M-CSF (Peprotech, NJ, USA)를 첨가하여 18시간 동안배양한 후 배양접시 바닥에 부착되지 않은 비부착 세포들은 회수하여 추가로 3일간 배양하여 BMMs를 제작하여 사용하였다. 이 연구는 순천대학교 동물실험 기준 계획서의 권고사항을 엄격히 준수했다(승인번호: SCNUIACUC 2021). 실험을 위한모든 세포는 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 배양되었으며 3일에 한번씩 새로운 배양액으로 교체되었다. 파골세포 분화 억제 실험은 BMMs를 96-well plate에 1×10⁴ 개/well의 농도로 접종하여 30 ng/mL M-CSF와 10 ng/mL RANKL이 함유된 10% α-MEM에0.1% DMSO 또는 savinin을 처리하여 4일 동안 배양하면서 savinin의 파골세포 분화 억제 활성을 확인하였다.

TRAP 염색 분석

파골세포 활성 억제 여부 확인을 위한 실험 시료가 처리된 세포는 10% formalin으로 5분 동안 처리되어 고정되었고, 0.1%Triton X-100이 10분 정도 처리되어 세포막의 투과성을 높였다. 이후 TRAP 염색액(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 첨가해서 세포를 염색하였다. 염색 후 성숙한 파골세포의 개수를 세기 위한기준으로 세포 내에 3개 이상의 핵을 함유하고 있는 TRAP 양성 세포(TRAP-positive MNCs)를 선정하여 개수를 세었다.

세포독성 분석

처리한 시료의 세포독성을 확인하기 위하여 파골세포를 96 well plate에 1×10⁴ 개/well의 농도로 접종을 한 후 다음날 30ng/mL 농도의 M-CSF를 10% FBS α-MEM에 넣어주고, 0.1%DMSO 또는 savinin을 처리하여 3일 동안 배양하였다. 세포 독성여부 분석을 위하여 CCK-8 kit (Dojindo Molecular Technologies, JP)를 사용하였으며 분석방법은 시약사의 메뉴얼에 따라 수행되었다.

Real-time PCR analysis

파골세포 관련 유전자의 mRNA 발현 변화를 분석하기 위하여 6-well plate에 세포를 3.5×10⁵개/well의 농도로 접종한 후 30 ng/mL M-CSF와 10 ng/mL RANKL이 포함된 10% α-MEM에0.1% DMSO 또는 savinin을 처리한 후 0, 1, 2, 3 일 후에 수거하였다. 실험에 사용된 프라이머는 primer 3 프로그램을 이용하여 만들었으며 Table 1에 나타내었다.¹⁷⁾ Total RNA는 TRIzol 시약을 사용하여 추출하였고, cDNA는 M-MLV cDNA synthesis kit (Enzynomics, KR)를 이용해서 1μg의 total RNA로부터 만들어졌다. Quantitative real-time PCR은 TOPreal qPCR 2× PreMIX (Enzynomics, KR)와 Real-Time PCR Detection System (BioRad, CA, USA)을 이용해서 수행되었다. mRNA 발현량의 표준화를 위하여 house keeping gene으로 알려져 있는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 사용하였다.¹⁸⁾

Table 1

Primer sequences used in this study

Gene of interest	Primer sequence (5'→3')
	Sense	Anti-sense
NFATc1	GGGTCAGTGTGACCGAAGAT	GGAAGTCAGAAGTGGGTGGA
CTSK	GGCCAACTCAAGAAGAAAAC	GTGCTTGCTTCCCTTCTGG
DC-STAMP	CCAAGGAGTCGTCCATGATT	GGCTGCTTTGATCGTTTCTC
OSCAR	CTGCTGGTAACGGATCAGCTC	CCAAGGAGCCAGAACCTT
GAPDH	AACTTTGGCATTGTGGAAGG	ACACATTGGGGGTAGGAACA

Western blot analysis

배양된 세포의 단백질 발현량을 확인하기 위하여 Lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% v/v Igepal CA-630, 150 mM NaCl, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium orthovanadate, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 μg/mL Aprotinin, 5 μg/mL Leupeptin, and 2 μg/mL Pepstatin)를 사용해 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질(20 μg)을 10%SDS-PAGE에 전기영동을 수행한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Amersham Biosciences, NJ, USA)을 이용하여 단백질을 옮긴 후 1차 Ab를 4oC에서 16시간 동안 반응시킨후 horse radish peroxidase(HRP)가 결합된 2차 Ab를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 1% Tween 20을 포함한 TBS를 사용하여 세척한 후 Super-Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce Chemical, Rockford, IL, USA)를 사용하여 반응시킨 후MicroChemi 4.2 (DNR Bio-imaging System, Jerusalem, IL, USA)에 의해 단백질 밴드의 intensity를 확인하였다.

Pit resorptive assay

시료의 파골세포 억제 활성을 확인하기 위하여 96 well Corning^® Osteo Assay Surface plate에 분화된 파골세포를 적용한 후 savinin을 처리하여 plate 바닥의 침식 정도를 분석하였다.

통계학적 분석

본 연구에서 수행한 결과는 3번 반복하였고, 통계적 차이는Student’s t-tests에 의해 분석되었다. Probability (p) 값이 0.05 이하일 때 유의적인 것으로 간주했다(p값 *<0.05, **<0.01, ***<0.001).

파골세포에 대한 savinin의 분화 억제 효과

파골세포 분화에 미치는 savinin의 억제 활성을 확인하기 위하여 RANKL을 BMMs에 처리하여 파골세포로 분화시키고 0.1%DMSO 또는 savinin (0, 1, 3, 10μM)을 대식세포에 처리한 후 4일간 배양하였다. DMSO를 처리한 대식세포는 RANKL에 의해TRAP+-MNCs로 분화되었지만 savinin을 처리한 실험군에서는 파골세포의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 실험결과를 정량적으로 분석하기 위하여 파골세포가 분화되었을 경우 관찰되는 다핵세포를 관찰하였다. 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP+-MNCs의 개수를 확인하였을 때 savinin의 농도 3μM이상에서 유의적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).

Fig. 2. Savinin suppressed osteoclast differentiation. (A) Osteoclast differentiation was induced for 4 days and TRAP staining was performed.(B) TRAP-positive multinucleated cells (nuclei ³3) were considered osteoclasts. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (n=3). (C) Cytotoxicity of savinin on BMMs was evaluated by performing CCK-8 assays.

BMMs에서 savinin의 독성 확인

파골세포 생성의 억제가 savinin에 의한 세포 독성 때문인지 아닌지를 확인하기 위해 BMMs를 사용하여 세포 독성 실험을 수행하였다. BMMs를 M-CSF (30 ng/mL)의 존재하에 0.1% DMSO 또는 savinin (0, 1, 3, 10μM)이 처리된 10% α-MEM에서 3 일간 배양하였다. 실험 결과 savinin 처리군 10μM까지도 독성이 없는 것으로 확인되었다(Fig. 2C).

파골세포 분화 관련 주요 인자의 mRNA 발현 억제에 미치는 savinin의 영향

RANKL에 의하여 유도되는 파골세포 분화 메커니즘에 미치는 savinin의 효과를 분석하기 위하여 파골세포 형성에 필요한 전사인자인 NFATc1과 파골세포 분화에 관여하는 유전자의 전사수준에서의 발현을 분석하였다. Savinin을 처리하지 않은 실험군에서는 RANKL에 의해서 NFATc1의 전사수준에서의 유전자발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 savinin을 처리하였을 때 NFATc1의 전사수준에서의 발현이 유의적으로 감소한것을 확인할 수 있었다. 또한 savinin은 파골세포 분화 과정에 관여하는 유전자들인 CTSK, DC-STAMP, OSCAR의 mRNA 발현을 유의적으로 감소시켰다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of savinin on RANKL-stimulated mRNA expressions of osteoclast-realated genes. Effects of savinin on RANKL-mediated NFATc1, CTSK, DC-STAMP, and OSCAR expressions over a three-day period. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the internal control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (n=3).

Savinin에 의한 NFATc1 단백질 발현 억제

파골세포 분화의 주요 조절 인자인 NFATc1의 번역수준에서의 발현에 미치는 savinin의 효과를 확인하기 위하여 western blotting 실험을 수행하였다. Savinin을 처리하였을 때 RANKL에의해 유도 발현된 NFATc1의 번역수준에서의 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 결과를 종합해보면savinin이 NFATc1의 전사수준과 번역수준에서 발현을 감소시켜 파골세포 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 4. Savinin abolished RANKL-mediated protein expression of NFATc1. The expression of NFATc1 protein under RANKL and savinin treatments were analyzed by western blotting with calibration based on the β-actin loading amount. Protein expression was analyzed by western blotting using β-actin as the loading control. *p<0.05, **p<0.01 (n=3).

Savinin에 의한 파골세포 활성 억제 검증

Pit resorptive assay 분석법을 이용하여 savinin이 분화된 파골세포의 활성을 억제하는지를 확인하였다. RANKL 등에 의해 분화된 파골세포는 뼈를 흡수하는 활성을 가지고 있어서 savinin을 처리하지 않았을 때 골흡수 활성이 강하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 그러나 savinin 처리 시 골흡수가 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5. The inhibitory effect of savinin on bone resorption by RANKL-treated osteoclasts. The inhibitory effects of savinin were measured using Osteo Assay Plates. (A) After 4 days of culture, the pits were observed under a light microscope, (B) The effect of savinin on the pit area decreased at 1, 3 nM. Pit areas were quantified using Image J. *p<0.05; ***p<0.001 (n=3).

뼈는 사람의 골격을 이루고 있으며, 칼슘, 인산염 등의 무기질과 유기질 등으로 구성된다. 골다공증은 파골세포에 의한 뼈손실과 미세조직의 소실에 의한 뼈의 양과 뼈 조직의 강도가 감소하는 뼈 관련 질환이다. 인구 고령화와 다양한 외부 요인에 의하여 골다공증 환자가 점점 증가하고 있어서 우리나라를 포함한 미국, 유럽, 일본 등 주요 국가의 골다공증 시장은 고령층인구 확대, 골다공증에 대한 인식 증가, 골다공증 관련 의료비지출 증가 등에 힘입어 2024년에는 10년 전과 비교하였을 때 2배 가까이 증가할 것으로 전망된다.^19-20) 이와 같이 전 세계적으로 심화되고 있는 고령화로 인한 골다공증 환자의 증가로 인하여 사회 경제적인 문제가 대두되고 있으므로 골다공증을 예방또는 치료하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 현재 시판되고 있는 골다공증 예방 및 치료제는 장기 사용 시 부작용을 일으킬 수 있는 단점들이 보고되고 있어서, 본 연구에서는 이러한 단점을 보완할 수 있는 골다공증 예방 및 치료를 위한 활성소재를 발굴하기 위한 연구로서 소재 발굴 관련 실험이 진행되었다. 건강한 뼈는 노화된 뼈를 제거하는 파골세포에 의한 골흡수과정과 새로운 뼈를 만드는 조골세포에 의한 골형성 과정이 균형을 유지하면서 항상성을 유지한다. 이러한 골 항상성 현상을 골 재형성(bone remodeling)이라 한다.^21,22) 파골세포는 골수의 조혈모세포로부터 만들어져서 오래된 뼈를 흡수하는 세포이다. 단핵/대식세포는 M-CSF와 RANKL 등의 사이토카인에 의하여 다핵세포로 분화하여 성숙된 세포로 만들어지며, 그 과정은 RANKL-RANK 상호작용에 의한 신호전달을 매개로 하여 조절된다. 사이토카인인 RANKL이 파골세포의 세포막에 위치하는 수용체RANK에 결합하면 p38, ERK, JNK 같은 MAPK의 인산화를 통하여 하위 인자에게 신호를 전달하게 되고, 파골세포의 분화와활성 과정에서 필수적인 역할을 수행하는 전사 인자로 알려진 NFATc1의 활성이 촉진되고 다핵세포로의 분화에 관여하는 여러 유전자를 촉진하여 파골세포가 형성된다.^23-28)

T 세포에서 발견된 NFAT 계열의 전사 인자에 의하여 골다공증의 파골세포 분화가 조절된다고 알려져 있으므로 savinin을 처리하였을 때 NFATc1의 전사수준과 번역수준에서의 발현량을 확인하기 위하여 각각 real-time PCR과 western blotting을 수행하였다. 파골세포가 분화하면서 RANKL에 의한 신호가 중간 매개체를 통하여 NFATc1에 전달될 때 파골세포 분화 관련 유전자인 DC-STAMP, CTSK, 그리고 OSCAR의 유전자 발현 또한 분석하였다. Savinin에 함유된 페닐프로파노이드계 성분은 항염과 항산화에 관여하는 물질로 알려져 있으므로 염증 반응에 효과가 있다고 알려져 있다. Savinin의 이와 같은 항염, 항산화 활성과 파골세포 분화 억제 활성을 통한 골다공증 예방 및 치료효과가 연관이 있을 것으로 생각되어 관련 실험을 수행하여 관련 효과가 있음을 확인하였다.

Savinin의 파골세포 분화 억제 활성은 본 연구의 결과와 같이in vitro 실험을 통하여 농도별 세포 분화 억제 실험과 전사와 번역 수준에서의 관련 유전자의 억제 활성, 그리고 pit assay를이용한 뼈 미네랄 성분의 소실 억제로 확인하였다. 향후 후속연구를 통하여 in vitro 상에서 검증된 savinin의 파골세포 억제활성을 in vivo 모델 마우스를 이용하여 검증해야 할 것으로 생각되지만 기존에 본 연구실에서 실험한 다른 활성소재의 결과를 근거로 savinin을 적절한 투여경로로 투여한다면 뼈에서 확산이 잘 되어 골수세포가 파골세포로 분화되는 것을 억제하여 항골다공증 효과를 나타낼 것으로 기대된다.^29-30)

본 연구의 결과를 전체적으로 정리하면 savinin은 RANKL에의하여 유발되는 파골세포 분화 과정을 효과적으로 억제시켰으며, 이러한 억제 효과는 세포를 사멸시키는 독성에 의한 것이 아니고 파골세포의 분화를 억제할 수 있는 세포 내의 메커니즘을 조절하여 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 파골세포 분화의 주요 조절 인자인 NFATc1의 전사수준 및 발현수준에서의 유전자 발현을 효과적으로 감소시켰으며, 관련 유전자들의 전사수준에서의 발현량도 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 pit resorptive assay를 수행하여 savinin이 모사된 뼈 조직에서도 파골세포 억제 활성을 가지고 있다는 것을 검증하였다.

Savinin은 RANKL-RANK 결합에 의하여 유도되는 파골세포분화과정의 주요 조절자인 NFATc1의 유전자 발현을 억제하여파골세포의 분화를 억제한다는 결과를 얻었다. 또한 NFATc1의전사수준과 번역수준에서의 유전자 발현 감소로 인하여 파골세포의 관련 인자들인 DC-STAMP, CTSK, 그리고 OSCAR의 발현이 억제됨을 검증하였다. 추가적으로 in vitro 실험으로 savinin의 파골세포 활성 억제를 pit resorptive assay로 검증하였다. 이상의 결과를 통하여 savinin을 골형성과 골흡수의 불균형에 의해 초래되는 골다공증의 예방 및 치료를 위한 효과적인 소재로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.

이 논문은 순천대학교 교연비 사업에 의하여 연구되었다.

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.