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Discovery of 2-Anilinopyrimidine-based Selective Inhibitors against Non-small Cell Lung Cancer Cell Line H1975
Yakhak Hoeji 2022;66(6):345-349
Published online December 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Jinyoung Lee*,†, Sou Hyun Kim*,**,†, Seung Tae Kim*, Heegyu Kim*, Huu Long Nguyen*, Young-Suk Jung*,**,#, and Hwayoung Yun*,**,#

*College of Pharmacy, Pusan National University
**Research Institute for Drug Development, Pusan National University
Correspondence to: Young-Suk Jung, College of Pharmacy and Research Institute for Drug Development, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea
Tel: +82-51-510-2816, Fax: +82-51-513-6754
E-mail: youngjung@pusan.ac.kr

Hwayoung Yun, College of Pharmacy and Research Institute for Drug Development, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea
Tel: +82-51-510-2810, Fax: +82-51-513-6754
E-mail: hyun@pusan.ac.kr

These authors contributed equally to this work.
Received October 27, 2022; Revised December 17, 2022; Accepted December 20, 2022.
Abstract
Small molecular EGFR-tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs) have been proved as a successful and powerful strategy for the treatment of non-small-cell lung cancer (NSCLC). Recent studies have reported that the T790M mutation in EGFR is the most prevalent factor in acquired resistance for NSCLC patients. In an effort to identify small molecules for the inhibition of T790M mutant EGFR, a screening of our in-house chemical library was conducted by an MTT assay. A set of 2-anilinopyrimidine derivatives was rationally selected and then evaluated for their antiproliferative activities against three different type of NSCLC cell lines H358 (EGFR wild-type), HCC827 (EGFR exon 19 deletion) and H1975 (EGFR L858R/T790M double-mutant). Compounds 9, possessing a piperidine in the part A and a 4-methylpiperidine in the part B, selectively showed inhibitory activity in the T790M mutant cell line. In addition, in silico studies of 9 utilizing a SwissADME tool exhibited good drug-like properties.
Keywords : 2-Anilinopyrimidine, NSCLC, EGFR, T790M, In-house chemical library
서 론(Introduction)

전세계적으로 암으로 인한 사망의 주요 원인이 폐암이며, 전체 폐암의 2/3 이상이 비소세포폐암(non-small-cell lung cancer, NSCLC)이다.1) 비소세포폐암은 조직학적 특징을 기준으로 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)으로 분류되는데 선암이 가장 많은 발생빈도를 차지한다.2) 비소세포폐암의 치료제 개발을 위해서 많은 표적과 신호경로가 확인되었는데, 대표적으로 EGFR, ALK, PI3K/AKT/mTOR, RAS-MAPK, RET, MET, BRAF, NTRK/ROS1 등이 있다.3) 이중에서 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)의 돌연변이는 전체 선암 환자의 약 10-35%에서 확인되는데, 특히 동아시아 환자에서는 약 40-55%까지 관찰된다.4) 상피세포 성장인자 수용체는 수용체 티로신 인산화효소(receptor tyrosine kinase, RTK)의 일종으로 세포 내 비정상적인 신호전달을 지속적으로 유도하는 돌연변이가 발생하면 암세포의 분화, 생존, 전이에 관여한다.5) 따라서, 선택적인 EGFR-TKI가 비소세포폐암의 표준 치료제로서 개발되어 임상에서 널리 활용되고 있다.6,7)

1세대 EGFR-TKI는 EGFR 활성화 돌연변이를 가진 비소세포폐암 환자에게 효과적인 약물이며 대표적으로 gefitinib과 erlotinib이 있다.8) 이들은 ATP 결합 부위에 경쟁적이고 가역적으로 결합하여 암세포의 EGFR 신호전달 활성화를 막는다. 2세대 EGFRTKI는 1세대 EGFR-TKI에 대한 암세포의 저항성을 개선하기 위해서 개발되었다. 대표적인 약물로 afatinib과 dacomitinib이 있으며 ATP 결합 부위에 비가역적으로 결합하고 ErbB family에 속한 다른 수용체도 동시에 억제한다는 특징이 있다.9,10) EGFR-TK를 표적으로 하는 1, 2세대 약물에 대해서 내성을 보이는 암세포가 보고되었는데, 대표적인 기전으로는 MET의 증폭, PTEN의 결손, AXL의 활성화, HER2의 증폭, EGFR의 T790M 발현 등이 제시되었다.11-15) 이 중에서 T790M 돌연변이는 exon 20번의 790번 트레오닌이 메티오닌으로 치환된 것으로 ATP에 대한 친화도는 향상시키는 반면에 1, 2세대 EGFR-TKI에 대해서는 친화도를 감소시킨다. T790M 돌연변이는 내성 기전 중 가장 큰 비중을 차지하기 때문에 이 돌연변이를 표적으로 한 3세대 약물이 개발되었다. 대표적으로 osimertinib이 있으며 ATP 결합 부위의 797번 시스테인과 비가역적인 공유 결합을 형성한다.16) 그러나 비가역적 결합을 통해 EGFR-TK를 저해하는 약물들은 설사, 피부 발진, 구내염 등의 독성이 있을 수 있으므로 ATP보다 강력하게 결합하면서 T790M 돌연변이에 활성이 있는 가역적 저해제의 개발 연구가 필요하다.17)

본 연구의 목적은 약물성이 높은 in-house 화합물 라이브러리를 활용하여 1, 2세대 EGFR-TKI에 대해서 내성을 보이는 비소세포폐암 세포주를 선택적으로 저해할 수 있는 저분자 유효물질을 발굴하는 것이다. 스크리닝을 위한 화합물군을 선별하기 위해서 EGFR의 T790M 돌연변이 세포주를 저해하는 가역적 저분자화합물의 구조를 분석하였다. Takeda, Genentech, Blueprint Medicines사에서 발굴한 대표적인 저해제들은 구조 중심에 공통적으로 anilinopyridmidine 골격으로 구성되어 있어 in-house 화합물 라이브러리 중에서 2-anilinopyridmidine 스캐폴드를 선정하였다(Fig. 1).18-20) 세포생존률 저해 활성을 측정하기 위해서 야생형 H358 세포주, EGFR의 exon 19번이 결손된 HCC827 세포주 그리고 EGFR의 T790M 돌연변이를 갖는 H1975 세포주를 이용하였다.



Fig. 1. Rational selection from an in-house chemical library.

방 법(Methods)

화합물

본 연구에서 활용한 12종의 2-anilinopyridmidine 유도체는 부산대학교 약학대학 의약화학실험실에 in-house 화합물 라이브러리로서 구축된 것을 사용하였다. 각각의 화합물들은 10 mM 농도로 DMSO 용매에 녹여 4°C에서 보관 및 관리되고 있다.

세포배양

본 연구에서 사용한 3종의 인체 폐암세포주는 비소세포폐암 세포주 H358, EGFR 돌연변이 세포주 HCC827, EGFR-TKI 내성 세포주 H1975 (EGFR L858R/T790M double-mutant)이며, American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 배양조건은 10% fatal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT, USA), 1% penicillin/streptomycin (Hyclone)이 포함된 RPMI-1640 (Hyclone) 배지를 사용하였으며, 37°C와 5% CO2 조건을 유지하였다.

세포생존율 측정

세포생존율의 측정은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 활용하였으며, 화합물 처리전에 H358 (0.9×104cells/well), HCC827 (0.9×104cells/well), H1975 (1.5×104cells/well) 세포를 96 well plate에 각각 분주한 후 37°C와 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 다음 날 세포의 배양 배지를 제거하고 화합물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양 후 생존율을 측정하였다. 0.5 mg/mL의 MTT solution을 각 well에 50 μL씩 첨가하여 1시간 동안 반응시키고 각 well의 배지를 제거하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 well당 100 μL씩 분주하여 세포 내 formazan crystal을 용해시켜 반응을 종결시켰다. MULTISKAN GO reader (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하고 세포생존율을 산출하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

2-Anilinopyridmidine 유도체의 효율적인 4단계 합성법은 Scheme 1과 같다.21) Mitsunobu 반응을 진행하여 출발물질 4-nitrophenol (1)에 3-chloropropyl기를 먼저 도입한 후, tin(II) chloride dihydrate로 nitro기를 환원하여 aniline 중간체 3을 얻었다. 대량으로 합성한 중간체 3과 4가지 종류의 2-chloro-4-aminopyrimidines 4a-4d를 마이크로파 합성 반응기에서 친핵성 방향족 치환반응을 각각 진행하여 2-anilinopyridmidine 핵심 골격을 확립하였다. 최종 유도체 6-17은 중간체 2-anilinopyridmidine 5a-5d와 piperidine, morpholine, thiomorpholine을 염기성 조건 하에서 친핵성 치환반응을 각각 수행하여 합성 완료하였다.

합성한 유도체의 항암 활성을 평가하기 위해서 H358 세포주, HCC827 세포주, H1975 세포주에 MTT를 처리하여 세포생존율을 측정하였다(Table 1).22) 양성 대조약물로서 대표적인 1세대 EGFR-TKI인 gefitinib (IRESSA®)을 사용하였다. Part B에 상대적으로 친수성의 morpholine과 N-methylpyperazine 환을 도입한 유도체 12-17에서는 part A의 환 구조와 상관없이 3가지 세포주 모두에서 생존율 저해 효능이 나타나지 않았다. 반면에 Part B에 상대적으로 친유성의 piperidine과 4-methylpiperidine 환을 도입한 유도체 6-11에서는 대체로 H1975 세포주에 대해서 선택적 저해 효능을 보여주었다. 이 중에서 part A에 친수성의 morpholine과 thiomorpholine 환을 포함하는 유도체 7, 8, 10은 상대적으로 선택적 저해 효과가 낮았다. Part A에 친유성의 piperidine 환을 갖는 유도체 6과 9는 선택적 억제 효과를 나타냈는데, 유도체 9가 가장 효능이 우수하였다. 예외적으로 part A에 thiomorpholine, part B에 4-methylpiperidine 환으로 구성된 유도체 11은 H1975 세포주 뿐만 아니라 H358 세포주와 HCC827 세포주에서도 약한 저해 효능을 보였다.



Fig. 2. Scheme 1. Synthesis of 2-anilinopyrimidine derivatives 6-17.

Growth inhibitory effects of 6-17

Comp. IC50 (μM)a
H358 HCC827 H1975
6 > 30 > 30 15.9
7 > 30 > 30 22.7
8 > 30 > 30 21.4
9 > 30 > 30 7.6
10 > 30 > 30 26.4
11 23.2 21.0 5.4
12 > 30 > 30 > 30
13 > 30 > 30 > 30
14 > 30 > 30 > 30
15 > 30 > 30 > 30
16 > 30 > 30 > 30
17 > 30 > 30 > 30
Gefitinib - 0.2 > 30

aThe inhibitory activities of compounds were measured using the MTT assay.



신약후보물질로서 2-anilinopyridmidine 유도체들의 개발 가능성을 알아보기 위해서 웹기반의 SwissADME 프로그램을 활용하여 in-silico 물리화학적 및 약동학적 특성, 의약화학적 친화성과 약물성(drug-likeness)을 평가하였다.23) EGFR의 T790M 돌연변이를 갖는 H1975 세포주에 대해서 선택적 저해 효능을 보이는 유도체 6, 9, 11을 선정하여 그 분석 결과를 Table 2에 요약하였다. 3가지 유도체 모두 회전 가능한 결합(rotatable bond, RB)의 수가 8개이고 수소 결합 받개(hydrogen bond acceptor, HBA)의 수가 4개이며 수소 결합 주개(hydrogen bond donor, HBD)의 수가 1개로 동일하며, 이 수치들은 모두 lead-likeness의 범위(RB≤10, HBA≤9, HBD≤5)를 충족하였다.24) 이들 유도체들은 모두 TPSA (topological polar surface area)가 140Å 이하이며,25) LogS (−5.44~ −5.99) 값과 CLogP (3.74~4.02) 값도 이상적인 leadlikeness의 범위를 충족하였다.24) 또한, 위장관 흡수gastrointestinal absorption, GIA)가 높고, Lipinski, Veber, Egan 규칙에 모두 부합하므로 우수한 약물성(drug-likeness)을 나타낼 것으로 예측된다.

SwissADME physicochemical, pharmacokinetic, and drug-likeness prediction for compounds 6, 9, and 11

Comp. RBa HBAb HBDc TPSAd2) LogSe Sclassf CLogPg GIAh drug-likeness (# viol.)i
6 8 4 1 53.52 -5.44 MS 3.82 High Yes (0)
9 8 4 1 53.52 -5.89 MS 4.02 High Yes (0)
11 8 4 1 78.82 -5.99 MS 3.74 High Yes (0)

aNumber of rotatable bonds.

bNumber of H-bond acceptors.

cNumber of H-bond donors.

dTopological polar surface area.

eAli topological method LogS.

fAli solubility class (insoluble (IS)<-10<poorly soluble (PS)<-6<moderately soluble (MS)<-4<soluble (S)<-2<very soluble (VS)<0<highly soluble

(HS)).

gConsensus LogP (average of iLOGP, XLOGP3, WLOGP, MLOGP and Silicon-IT LogP).

hGastrointestinal absorption.

iNumber of violations of Lipinski, Veber and Egan filters.


결 론(Conclusion)

본 연구에서는 우수한 비소세포폐암 치료제인 1, 2세대 EGFRTKI에 대해서 심각한 내성을 갖는 T790M 돌연변이 세포주에 선택적 저해 활성을 보이는 유효물질을 발굴하고자 하였다. 기존에 잘 알려진 3세대 EGFR-TKI의 구조 분석 정보를 바탕으로 in-house 화합물 라이브러리에서 적합한 화합물군을 선별하고, 특성이 다른 3가지 인체 폐암세포주에서 생존율을 평가하였다. 활용한 2-anilinopyrimidine 골격의 유도체 중에서 part A에 piperidine, part B에 4-methylpiperidine 환으로 구성된 유도체 9가 T790M 돌연변이 세포주인 H1975에 대하여 선택적이고 우수한 저해 활성을 보여주었다. 유도체 9는 in-silico 물리화학적 및 약동학적 특성과 약물성도 탁월하여 향후 신약후보물질의 도출을 위한 전도유망한 유효물질이 될 것으로 기대된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연구된 것입니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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