search for




 

Effect of Hyperoside on Phorbol Ester-induced Gene Expression of Mucin and NF-κB Signaling in Cultured Human Airway Epithelial Cells
Yakhak Hoeji 2022;66(6):324-330
Published online December 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Hyun Jae Lee* and Choong Jae Lee**,#

*Smith Liberal Arts College and Department of Addiction Science, Graduate School, Sahmyook University
**Department of Pharmacology, School of Medicine, Chungnam National University
Correspondence to: Dr. Choong Jae Lee, Department of Pharmacology, School of Medicine, Chungnam National University, 266 Munhwa-ro, Joong-gu, Daejeon 35015, Korea
Tel: +82-42-580-8255
Fax: +82-42-585-6627
E-mail: LCJ123@cnu.ac.kr
Received September 27, 2022; Revised October 28, 2022; Accepted November 14, 2022.
Abstract
We investigated whether hyperoside, an anti-inflammatory natural product, significantly affects phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA)-induced airway expression of MUC5AC encoded mucin. Confluent NCI-H292 cells were pretreated with hyperoside for 30 min, then stimulated with PMA for 24 h or the indicated periods. MUC5AC mucin mRNA expression was measured by RT-PCR. MUC5AC mucin protein expression was quantitated by ELISA. To elucidate the mechanism of hyperoside action, we investigated the effect of hyperoside on PMA-induced NF-κB signaling by western blot analysis. The results were as follows: (1) Hyperoside significantly inhibited MUC5AC mucin protein production and down-regulated MUC5AC mucin mRNA expression; (2) Hyperoside inhibited PMA-induced activation (phosphorylation) of inhibitory kappa B kinase (IKK), thereby inhibiting phosphorylation and degradation of inhibitory kappa Bα (IκBα); (3) Hyperoside inhibited PMA-induced nuclear translocation of nuclear factor kappa B (NF-κB) p65, thereby down-regulating MUC5AC mucin gene expression in NCI-H292 cells. These results suggest that hyperoside can regulate mucin gene expression by airway epithelial cells through regulation of the NF-κB signaling pathway.
Keywords : Respiratory, Hyperoside, Mucin
서 론(Introduction)

인체의 호흡기는 공기의 통로인 기도(airway)와 산소와 이산화탄소의 교환이 일어나는 폐(lung)로 구성되어 있는데, 기도에 존재하는 점액(airway mucus)은 섬모세포와의 협동작용을 통해 호흡기를 통해 유입되는 각종 입자성 유해 물질, 병원성 미생물, 유해 자극성 기체로부터 인체를 보호함에 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 기도 점액의 생체방어 작용은 점액의 생화학적 주 구성요소인 점액성 당단백질, 즉 ‘뮤신(mucin)’의 점탄성(viscoelasticity)에 기인한다. 그러나, 뮤신의 양과 질의 이상은 기도 생리의 이상뿐 아니라 인체의 방어작용에 영향을 주어 극심한 병리적 현상을 유발할 수 있다. 다시 말해, 천식, 만성 기관지염, 폐기종, 기관지 확장증, 낭포성 섬유증 등의 호흡기 질환에서 관찰되는 점액(객담)의 과다 생성 및 분비, 점도의 비정상적 증가 등은 이러한 질환의 예후를 악화시키는 주된 요인으로 알려져 있다.1-4)

호흡기 질환의 치료 과정에서, 과다하게 생성되고 분비된 점액의 효율적 제거를 목적으로 N-acetyl L-cysteine (NAC), bromhexine, glucocorticoids, ambroxol, dornase-α, azithromycin, erdosteine, hypertonic saline solution, glyceryl guaiacolate, letocysteine, 2-mercaptoethane sulfonate sodium (MESNA), mannitol, S-carboxymethyl cysteine, myrtol, thymosin β-4, sobrerol 등과 같은 거담제(expectorants) 및 점액 용해제(mucolytics) 등이 임상적으로 사용되고 있으나, 그 약리작용 및 기전이 불명확하며 약물 투여 및 점액의 물리적 제거에 따르는 반사적 과다분비 현상 때문에 임상적으로 점액 과다분비 질환을 효율적으로 조절하기는 쉽지 않다.

현재, 임상적으로 기도 점액의 과다 분비를 유의하게 조절할 수 있는 약물은 강력한 항염증 작용을 발현하는 당질 코르티코이드계 약물로 알려져 있으나, 골다공증, 당뇨병, 고혈압 등 동반되는 광범위한 부작용으로 인해 치료 약물로서의 효용성에 제한점이 있기에, 유효하면서도 부작용이 적은 신약의 개발이 절실한 실정이다. 과다 생성 및 분비된 점액을 기도로부터 제거하는 데는 두 가지 방법이 있을 수 있다. 첫째, 물리적 방법에 의한 점액의 제거, 즉 점액의 점도를 낮춘 뒤 흡인해 내는 방법이고, 둘째는, 점액 생성 자체를 억제할 수 있는 약물의 투여이다. 그러나, 물리적 방법은 기도 내부의 자극을 유발하고, 반사기전에 의해 점액 분비를 오히려 자극할 수 있다. 마취 하에서 그런 방법이 시도된다고 해도, 점액의 제거는 feedback mechanism을 통해 점액의 생성과 분비를 더욱더 자극할 수 있다는 것이다. 따라서, 점액에 점성을 부여하는 주 구성요소인 뮤신의 생성 자체를 조절하거나 혹은 분비를 조절하기 위한 약리학적 접근은 호흡기 점액 과다분비 관련 질환의 치료에 있어 중요한 방향이 될 수 있다.5)

특히, 항염증, 항산화, 암예방 작용을 발현하는 것으로 알려진 다수의 천연물 가운데서 호흡기 염증성 질환에서 관찰되는 기도 뮤신의 과다분비 혹은 생성을 조절할 가능성이 있는 후보물질을 찾고자 하는 연구전략은 성공 가능성이 상대적으로 높다고 할 수 있을 것이다. 다수의 전통의학 문헌과 선행 연구보고에 의하면, 어성초(Houttuynia cordata)는 경험적으로 인체에 발생하는 다양한 염증성 질환의 치료를 위해 사용되어 왔으며, 하이퍼로사이드(Fig. 1)를 포함한 어성초에 함유된 천연물들은 항염증, 항산화 등 다양한 생리활성을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다.6-9)



Fig. 1. Chemical structure of hyperoside.

그러나, 현재까지 인간 기도 상피세포에서 상피세포 성장인자(EGF)에 의한 뮤신 생성 및 EGF 수용체 관련 신호전달 경로에 대한 하이퍼로사이드의 약리작용에 관한 본 연구진의 보고10) 이외에, 포볼 에스터에 의해 자극된 뮤신 유전자의 발현과 거기에 개재된 세포 내 신호전달 경로에 대한 하이퍼로사이드의 약리작용은 검증된 바가 없었다.

따라서, 본 연구에서는 기도 뮤신의 생성과 유전자 발현에 관계된 신호전달 경로의 연구에 가장 흔히 사용되고 있는 NCIH292 세포에서,11,12) PMA로 유발된 뮤신 유전자 발현에 대한 하이퍼로사이드의 작용과 하이퍼로사이드가 기도 뮤신 생성 신호 전달 경로 중 주요한 NF-κB 신호전달 경로에 대해 어떤 작용을 나타내는지 검증함으로써, 효과적인 기도점액 과다생성 및 분비 조절 신약의 개발을 위한 기초과학적 정보를 제공하고자 하였다.

방 법(Methods)

세포주 및 시약

NCI-H292 세포는 American Type Culture Collection사(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Protease inhibitor cocktail은 Roche사(Indianapolis, IN, USA)에서, mouse anti-MUC5AC clone 45M1 및 HRP-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate은 Neo-Markers사(Freemont, CA, USA)에서, hyperoside (purity: 97.0%), trypsin-EDTA, epidermal growth factor (EGF), Tween 20, bovine serum albumin (BSA), HEPES, dimethyl sulfoxide(DMSO), 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine peroxide solution (TMB), NP-40, EDTA, EGTA, ethidium bromide, diethylpyrocarbonate(DEPC) 등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서, Easy-Blue RNA extraction kit는 INTRON biotechnology사(Kyunggido, Korea)에서, Accuprep RT premix kit는 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서, PCR Master Mix는 ABgene사(Rochester, NY, USA)에서, penicillin-G, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), RPMI 1640은 GIBCO-BRL사(Grand Island, New York, USA)에서, Anti-NF-κB p65, anti-IκBα, anti-β-actin, anti-TRAF2, anti-TRADD antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)에서, Anti-nuclear matrix protein p84 (ab-487) antibody는 abcam사(Cambridge, MA, USA)에서, Anti-RIP1 antibody는 BD biosciences사(San Jose, CA, USA)에서, Phospho-specific anti-IκBα (serine 32/36), anti-phospho-IKKα/β (Ser176/180) Cell signaling Technology사(Danvers, MA, USA)에서, Goat Anti-rabbit IgG 및 Goat Anti-mouse IgG는 Calbiochem사(Carlsbad, CA, USA)에서, enhanced chemiluminescence kit (ECL kit)는 Thermo Scientific사(Pierce ECL western blotting substrate, Waltham, MA, USA)에서, 기타 제반 시약들은 일급시약 등급 이상의 것들을 구입하여 사용하였다.

인간 기도상피 세포 (NCI-H292) 배양 및 약물 처리

세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37°C 배양기 내에서 HEPES (25 mM), penicillin G (100 U/mL), streptomycin (100 μg/mL), FBS (10%, V/V) 등이 첨가된 RPMI 1640 배양액에서 배양하였는데, 1주에 2회 빈도로 subculture하였고 배양액은 2일마다 1회씩 교체하여 주었다. 뮤신 생성 및 그 유전자 발현에 대한 약물의 작용을 검증하기 위하여, 뮤신생성량 검증을 위해서는 24 well culture plate를 기준으로, well당 2.0×104 cells/well의 밀도로, 뮤신 유전자 발현 정도의 검증을 위해서는 6 well culture plate를 기준으로, well 당 5.0×104 cells/well의 밀도로 각각 세포를 도포하고 배양하였다. 세포가 각 well의 70-80% 정도를 차지할 정도로 자라면, FBS의 농도를 0.2%로 감소시킨 배양액을 주고 24시간 동안 배양하고, serum을 첨가하지 않은 배양액(serum-free medium)으로 세포를 세척한 후 약물 1, 2, 5, 10 μM을 함유하는 배양액 200 μL (24 well plate 기준)를 well마다 가하였다. 30분이 경과한 후 PMA (10 ng/mL)를 세포에 투여한 후 37°C에서 추가로 24시간 동안 배양하였다.10-12)

생성된 MUC5AC 뮤신의 정량 방법

각 약물의 처리 기간이 종료된 후, 배상세포 내 생성되어 저장되어 있는 뮤신을 정량하기 위하여, 세포 용해용 완충액(20mM Tris, 0.5% NP-40, 250mM NaCl, 3mM EDTA, 3mM EGTA, protease inhibitor cocktail)을 가하여 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 추출하였다. 즉시로, 효소연계 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 뮤신의 생성량을 다음과 같이 측정하였다. 뮤신을 함유하고 있는 배양 상층액 및 수거된 cell lysate를 각각 PBS로 1/10배 희석하고, 희석된 각 sample을 ELISA 전용의 96-well plate에 각각 100 μL씩 분포시킨 후 42°C에서 완전히 건조시켰다. 그 후 PBS-Tween 20 (0.05%, PBST) 용액 200 μL/well을 이용, 각 well 당 3회씩 세척하였다. 세척 후 PBS-T에 용해된 2% BSA 용액 200 μL를 각 well당 가하고 다시 1시간 동안 incubation하였다. 1시간 후 PBS-T 200 μL로 3회 세척하고MUC5AC에 대한 monoclonal antibody인 mouse anti-MUC5AC clone 45M1을 2% BSA에 1 : 200의 비율로 희석한 후에, 각 well당 100 μL씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다. 1시간 후 PBS-T로 3회 세척하고 2차 항체인 Horse radish peroxidase(HRP)-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate를 2% BSA에 1 : 3,000의 비율로 희석한 후, 각 well당 100 μL씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다. PBS-T로 다시 3회 세척 후 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine peroxide (TMB) 용액 100 μL를 각 well에 첨가하고 5분 후 1 N H2SO4 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 각 well의 흡광도를 측정함으로써 대조군과 약물처리군에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 정량하였다.10-12)

Total RNA의 분리

24시간 동안 약물을 처리한 세포를 냉각된 PBS로 2회 세척하였다. 세포에 trypsin-EDTA 용액을 처리하여 배양 용기 바닥으로부터 분리하고, 세포들의 혼합물을 1.5 mL 용량의 microtube에 옮겨 원심 분리함으로써 세포들만 수거하였다. 이어서, total RNA를 분리하고자 INTRON biotechnology사의 Easy-Blue RNA extraction kit (total RNA isolation reagent)를 이용해 (0.5 mL/4×105 cells) 세포를 lysis시키고, 상온에서 5분간 방치하였다. 5분 후 즉시, microtube 에 chloroform을 첨가, 15초간 vortexing 하고 상온에 2-3분간 방치한 후 4°C, 13,000 rpm (Hanil centrifuge MICRO 17 R, Seoul, Korea) 에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액 400 μL를 새 microtube에 옮겼다. 상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 잘 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하고 다시 4°C, 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물에 diethylpyrocarbonate (DEPC) 가 함유된 75% ethanol을 가하고 4°C, 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리함으로써 세척하였다. 수거된 RNA 침전물을 5분간 대기 중에서 건조시킨 후, 20 μL의 RNase-free water로 부유시키고, spectrophotometer(Beckman-Coulter, DU-650, Brea, CA, USA)를 사용하여 260 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 RNA의 농도를 측정한 후 실험에 사용하였다.13)

PCR (Polymerase Chain Reaction)을 위한 primer 제조

PCR에 사용된 primer는 전문 제조회사인 Genotec (주)(Daejeon, Korea)에 주문, 합성하였다. NCI-H292 세포에서의 human MUC5AC 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3', antisense primer의 염기서열은 5'-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGGG-3'이었다. 정량적 대조 유전자로 사용된 Rig/S15 유전자 primer의 염기서열은 (sense primer) 5'-TTC CGC AAG TTC ACC TAC C-3' 및 (antisense primer) 5'-CGG GCC GGC CAT GCT TTA CG-3'이었다.

RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

수거된 total RNA를 이용, 역전사 반응(Reverse Transcription)으로 cDNA를 만들고, 이를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다. 즉, 얻어진 total RNA 1 μg을 75°C에서 5분간 가열함으로써 denaturation 시키고, 이를 얼음에 담가 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다. MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응에서 얻은 cDNA 산물 2 μL를 PCR premix kit 의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다. 증폭반응을 위하여, PCR을 40회 실시(PCR thermal cycler, Takara MP-300, Japan) 하였으며, denaturation은 94°C에서 30초, annealing은 60°C에서 30초, extension은 72°C에서 30초간 각각 시행하였다.

전기영동에 의한 중합효소 연쇄반응 산물의 확인

RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 cDNA산물들을 전기영동으로 분리함으로써 MUC5AC 유전자 발현 변동 여부를 관찰하였다. 즉, 증폭된 PCR 산물 10 μL를 10×gel loading buffer (0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 50% glycerol)와 잘 혼합한 다음, Tris-acetate-EDTA buffer(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) 용액 및 1 μg/mL의 ethidium bromide가 함유된 1.0% agarose gel에서 전기 영동하였다. Gel상에서 이동된 각각의 DNA band는 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)를 이용하여 관찰하고, 사진 촬영하였다.

세포 추출물(whole cell extract)의 준비

150 mm culture dish에 배양하여 70-80% 정도 증식된 NCIH292 cells에, 37°C에서 15분 또는 24시간 동안 각 농도 별로 하이퍼로사이드를 전 처리하고 제시된 시간대 별로 PMA (10 ng/mL)를 처리하였다. 처리가 종료된 후, 세포는 ice-cold PBS로 2회 세척하고 3× trypsin-EDTA solution을 처리한 후 세포만 조심스럽게 수거하여 3 mL PBS를 함유하는 15 mL 시험관에 옮겨두었다. 이 세포 현탁액을 3,000 rpm, 4°C (Hanil centrifuge, MICRO 17 R, Seoul, Korea) 조건에서 5분간 원심분리한 후, 상등액은 제거하고 침전물(cell pellet)에 RIPA buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 30분 동안 처리하였다. 얻어진 세포 추출물을 14,000 rpm, 4°C (Hanil centrifuge, MICRO 17 R, Seoul, Korea) 조건에서 15분간 원심분리한 후 상등액을 즉시 후속 실험에 사용하거나 −80°C 조건에서 보관하였고, 후속 실험에 사용하기 전에 각 분획 중의 총 단백질량은 Bradford method를 이용하여 측정되었다.

핵 분획과 세포질 분획의 준비

150 mm culture dish에 배양하여 70-80% 정도 증식된 NCIH292 cells에, 37°C에서 24시간 동안 각 농도 별로 하이퍼로사이드를 전 처리하고 제시된 시간대 별로 PMA (10 ng/mL)를 처리하였다. 처리가 종료된 후, 세포는 ice-cold PBS로 2회 세척하고 3× trypsin-EDTA solution을 처리한 후 세포만 조심스럽게 수거하여 3 mL PBS를 함유하는 15 mL 시험관에 옮겨 두었다. 이 세포 현탁액을 1,200 rpm, 4°C (Hanil centrifuge, MICRO 17 R, Seoul, Korea) 조건에서 3분간 원심분리한 후, 상등액은 제거하고 침전물 (cell pellet)에 PBS를 가하고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재현탁시켰다. 이후 NE-PER® nuclear and cytoplasmic extraction reagent (Thermo-Pierce Scientific, Waltham, MA, USA)를 제조자의 지시에 따라 적용함으로써 세포질 분획과 핵분획을 분리 수거하였다. 각 분획은 −20°C 조건에서 보관되었고, 다음 단계의 실험에 사용되기 전에 각 분획 중의 총 단백질량은 Bradford method를 이용하여 측정되었다. Inhibitory kappa B kinase α/β (IKKα/β)의 인산화, inhibitory kappa Bα (IκBα)의 인산화 및 분해 단계에 미치는 약물의 작용 검증

IKKα/β, IκBα 단백질을 함유하는 세포 추출물 또는 세포질 분획(50 μg as protein)을 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동하였다. Gel 상에서 분리된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 전기적으로 흡착시켰고 0.05% Tween 20을 함유하는 5% skim milk in PBS로 blocking한 후, IκBα 또는 각 인산화 단백질들에 대한 primary antibody를 첨가하고 반응을 진행시켰다. 0.05% tween 20을 함유하는 PBS로 세척한 후 horseradish peroxidase가 부착된 secondary antibody를 첨가하고 반응을 진행시켰다. 결과로 생성되는 immunoreaction band는 enhanced chemiluminescence kit (Pierce ECL western blotting substrate, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 제조자의 설명에 따라 적용함으로써 가시적으로 검출해 내고 대조군, PMA 단독군, 하이퍼로사이드 처리군 별로 상호 비교하여 하이퍼로사이드가 IKKα/β의 인산화, IκBα의 인산화 및 분해 단계에 미치는 작용을 검증하였다.

NF-κB p65의 핵으로의 이동 단계에 미치는 약물의 영향 검증

NF-κB p65단백질을 함유하는 핵 분획 (50 μg as protein)을 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동하였다. Gel 상에서 분리된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 전기적으로 흡착시켰고 0.05% Tween 20을 함유하는 5% skim milk in PBS로 blocking한 후, primary antibody against NF-κB p65를 첨가하고 반응을 진행시켰다. 0.05% tween 20을 함유하는 PBS로 세척한 후 horseradish peroxidase가 부착된 secondary antibody를 첨가하고 반응을 진행시켰다. 결과로 생성되는 immunoreaction band는 enhanced chemiluminescence kit(Pierce ECL western blotting substrate, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 제조자의 설명에 따라 적용함으로써 가시적으로 검출해 내고 대조군, PMA단독군, 하이퍼로사이드 처리군 별로 상호 비교하여 하이퍼로사이드가 NF-κB p65단백질의 핵으로의 이동 단계에 미치는 작용을 검증하였다.

통계처리

모든 측정 결과는 Mean±SEM으로 환산한 후, 약물 처리군의 측정치는 대조군 측정치의 백분율로 나타냈다. 통계처리는 oneway ANOVA 및 post-hoc test 로서 Holm-Sidak test를 이용하였으며 p<0.05인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

인간의 호흡기에 존재하는 뮤신은 펩티드 골격과 탄수화물 가지로 이루어진 수백만 dalton의 분자량을 가진 당단백질(glycoprotein)로서, 뮤신의 펩티드 골격을 coding 하는 유전자를 MUC로 약칭하는데 현재까지 MUC 1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20 등 20여종 이상의 MUC 유전자가 발견되었으며, 이 중에 MUC5AC와 MUC5B 유전자의 산물인 MUC5AC와 MUC5B 뮤신이 인간의 호흡기에서 발견되는 gel-forming mucin을 구성하고 있다.1,14)

인체 기도 뮤신의 분비, 생성, 유전자 발현 조절과 연관된 연구모델로 자주 사용되는 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포에 대해, protein kinase C (PKC), diacylglycerol (DAG)의 내인성활성화 인자인 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)는 유전자 전사와 세포분화를 조절할 수 있는 염증성 자극인자로서 MUC5AC 뮤신 유전자의 발현을 유도할 수 있음이 보고되어 있다.15-17)

이러한 선행 연구정보에 근거하여 수행된 본 연구에서는, 호흡기 뮤신의 유전자 발현 조절과 관련된 연구모델로 가장 보편적으로 사용되는 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포에 대해, 하이퍼로사이드가 PMA에 의해 유발된 기도 뮤신 유전자 발현의 전사(mRNA 발현) 및 번역(당단백질의 생성) 단계에서 어떠한 작용을 나타내는 지 우선 검증하고자 하였다.

Fig. 2에서 볼 수 있는 것처럼, 하이퍼로사이드는 PMA로 유발된 MUC5AC mucin mRNA의 발현을 억제하는 경향을 보여주었다(Fig. 2). 동시에, 하이퍼로사이드는 NCI-H292 세포에서 PMA로 유발된 MUC5AC 뮤신 당단백질의 생성을 5 μM 및 10 μM의 처리 농도에서 유의하게 억제하였다. 각 처리 농도 별 시료 내 뮤신의 양은 각각 100±4% (control), 259±10% (10 ng/mL of PMA alone), 238±15% (PMA plus hyperoside1 μM), 210±16%(PMA plus hyperoside 2 μM), 119±11% (PMA plus hyperoside 5 μM) and 56±3% (PMA plus hyperoside 10 μM)이었다(Fig. 3). 동시에, 이러한 결과는 하이퍼로사이드가 기도 상피세포에 직접 작용하여 전사 및 번역 단계에서 뮤신 유전자 발현을 조절할 가능성이 있음을 시사하고 있는 것이다.



Fig. 2. Effect of hyperoside on PMA-induced MUC5AC mucin mRNA expression from NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of hyperoside for 30 min and then stimulated with PMA (10 ng/mL), for 24 h. Cell lysates were collected for measurement of MUC5AC mRNA expression using RTPCR. Three independent experiments were performed, and the representative data were shown (cont: control, H: hyperoside, H1: hyperoside 1 μM, H2: hyperoside 2 μM, H5: hyperoside 5 μM, H10: hyperoside 10 μM, concentration unit is μM).



Fig. 3. Effect of hyperoside on PMA-induced MUC5AC mucin production from NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of hyperoside for 30 min and then stimulated with PMA (10 ng/mL), for 24 h. Cell lysates were collected for measurement of MUC5AC mucin production by ELISA. Each bar represents a mean±SEM of 3 culture wells compared to the control set at 100%. Three independent experiments were performed, and the representative data were shown. * significantly different from control (p<0.05). + significantly different from PMA alone (p<0.05) (cont: control, H: hyperoside, H1: hyperoside 1 μM, H2: hyperoside 2 μM, H5: hyperoside 5 μM, H10: hyperoside 10 μM, concentration unit is μM).

한편, MUC5AC 유전자의 주요 전사조절 인자로 알려진 NF-κB는 세포질 내에서 IκB (inhibitory kappa B)와 결합되어 불활성 상태로 있지만, PMA에 의한 자극에 의해 비활성 상태의 IKK(inhibitory kappa B kinase)가 활성화됨으로써 이어 IκBα가 인산화되고 분해(degradation)되면, p65로 대표되는 단백질들이 세포핵 내로 이동(전위, translocation)함으로써 MUC5AC 유전자의 전사를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.18,19)

본 연구에서는 이러한 연구정보에 기반을 두고, 하이퍼로사이드의 분자 수준에서의 약리작용 기전을 규명하고자 NCI-H292 세포에서 PMA-유발 NF-κB 신호전달 경로에 대한 약물의 작용을 탐색하였다. Fig. 4의 (A)에서 볼 수 있는 것처럼 하이퍼로사이드는 PMA에 의하여 유발된 IKK의 인산화를 억제함으로써 후속 신호전달의 과정을 억제할 가능성을 나타내었다. 다음으로, (B)에서 볼 수 있는 것처럼 PMA에 의해 유발된 IKK 인산화의 결과로 IκB의 인산화가 유발되었는데, 하이퍼로사이드는 IκB의 인산화도 억제하였으며, 이어서 나타나는 IκB의 분해(degradation) 현상도 억제하는 경향을 보여주었다. 최종적으로 (C)에 나타난 바와 같이 PMA는 상위 신호전달 과정을 경유하여 MUC5AC 뮤신 유전자의 발현을 촉발하는 전사인자인 NF-κB p65의 핵 내로의 이동을 자극하였으나, 하이퍼로사이드는 p65의 핵 내로의 이동을 억제할 가능성을 보여주었다. Fig. 4(C)는, 핵 단백질인 p65의 핵 내 존재량을 측정한 결과를 나타내기 때문에, 핵 내에서 항상 일정하게 발현하는 것으로 (house-keeping) 이미 잘 알려진 핵 단백질인 p84를 정량한 결과를 첨부하여 p65 함량 측정의 적정성을 제시하였다. 이러한 전체 신호전달 경로에서의 각 분자들에 대한 하이퍼로사이드의 작용은 최종적으로 MUC5AC 뮤신 유전자의 발현을 억제하는 결과로 이어지는 것으로 판단된다.



Fig. 4. Effect of hyperoside on PMA-induced phosphorylation of IKKα/β and IκBα, degradation of IκBα, and translocation of NF-κB p65 in NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were incubated with varying concentrations of hyperoside for 24 h and treated with 50 ng/mL PMA for 30 min. Whole cell lysates (50 μg) were prepared and then subjected to western blot analysis using phospho-specific IKKα/β (Ser 176/180) antibody (A). Cytoplasmic extracts were fractionated and then subjected to western blot analysis using phospho-specific IκBα (Ser 32/36) antibody or antibody against anti-IκBα (B). The results shown are the representative of three independent experiments. Equal protein loading was evaluated by β-actin levels. Nuclear protein extracts were prepared and subjected to western blot analysis using antibody against p65 (C). The result shown is a representative of three independent experiments. As a loading control, p84 levels were analyzed (cont: control, H: hyperoside, H10: hyperoside 10 μM, H20: hyperoside 20 μM, H30: hyperoside 30 μM, IKKα/β: Inhibitory kappa B kinase α/β, IκBα: inhibitory kappa Bα. concentration unit is μM).

이상의 연구결과를 요약하면, 하이퍼로사이드의 기도 뮤신 유전자 발현에 대한 저해작용은, IKK - IκBα - NF-κB p65 신호전달체계에 영향을 미침으로써 나타날 수 있음을 시사한다. 본 연구에서 얻어진 이러한 지견들은, 민간에서 어성초를 다양한 염증성 질환의 조절을 위해 경험적으로 사용해 왔던 기초과학적 근거를 일부 제시하고 있다. 후속 연구를 통하여 하이퍼로사이드를 호흡기 점액의 과다생성 및 분비를 보이는 천식, 만성 기관지염 등 다양한 호흡기 염증성 질환의 진행 과정에서 기도 뮤신의 과다한 생성 및 분비 억제에 초점을 둔, 점액 조절용 신약후보물질로 개발할 가능성을 제고해야 할 것으로 판단된다.

결 론(Conclusion)

항염증성 천연물인 하이퍼로사이드는 포볼 에스터인 PMA에 의해 유발된 기도 뮤신의 유전자 발현을 억제하는데, IKK의 인산화, IκBα의 인산화 및 분해, NF-κB p65의 핵 내로의 전위(translocation)로 이어지는 신호전달 체계를 저해함으로써 최종적으로 MUC5AC 뮤신의 생성(production)을 조절할 가능성을 제시하였다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

References
  1. Rogers DF, Barnes PJ (2006) Treatment of airway mucus hypersecretion. Ann Med 38(2): 116-125.
    Pubmed CrossRef
  2. Voynow JA, Rubin BK (2009) Mucins, mucus, and sputum. Chest 135(2): 505-512.
    Pubmed CrossRef
  3. Kim KD, Lee HJ, Lim SP, Sikder MA, Lee SY, Lee CJ (2012) Silibinin regulates gene expression, production and secretion of mucin from cultured airway epithelial cells. Phytother Res 26(9): 1301-1307.
    Pubmed CrossRef
  4. Ko KH, Lee CJ, Shin CY, Jo M-J, Kim KC (1999) Inhibition of mucin release from airway goblet cells by polycationic peptides. Am J Physiol 277(21): L811-815.
    Pubmed CrossRef
  5. Mutschler E, Derendorf H (1995) Drug actions. CRC press, Inc., Boca Raton, Florida: p 410-411.
  6. Shingnaisui K, Dey T, Manna P, Kalita J (2018) Therapeutic potentials of Houttuynia cordata Thunb. against inflammation and oxidative stress: A review. J Ethnopharmacol 220: 35-43.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Wei Y, Luo QL, Sun J, Chen MX, Liu F, Dong JC (2015) Bu-Shen-Yi-Qi formulae suppress chronic airway inflammation and regulate Th17/Treg imbalance in the murine ovalbumin asthma model. J Ethnopharmacol 164: 368-377.
    Pubmed CrossRef
  8. Xiao R, Xiang AL, Pang HB, Liu KQ (2017) Hyperoside protects against hypoxia/reoxygenation induced injury in cardiomyocytes by suppressing the Bnip3 expression. Gene 629: 86-91.
    Pubmed CrossRef
  9. Ye P, Yang XL, Chen X, Shi C (2017) Hyperoside attenuates OVA-induced allergic airway inflammation by activating Nrf2. Int Immunopharmacol 44: 168-173.
    Pubmed CrossRef
  10. Lee HJ (2022) Effect of Hyperoside on the Gene Expression and Production of Mucin and PMAR-p44/42-Sp1signaling Pathway in Airway Epithelial Cells. Yakhak Hoeji. 66(2): 104-109.
    CrossRef
  11. Shao MX, Ueki IF, Nadel JA (2003) TNF-alpha converting enzyme mediated MUC5AC mucin expression in cultured human airway epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100(20): 11618-11623.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Song KS, Lee WJ, Chung KC, Koo JS, Yang EJ, Choi JY, Yoon JH (2003) IL-1beta and TNF-alpha induced MUC5AC overexpression through a mechanism involving ERK/p38 mitogen-activated protein kinase-MSK1-CREB activation in human airway epithelial cells. J Biol Chem 278(26): 23243-23250.
    Pubmed CrossRef
  13. Karlinsey J, Stamatoyannopoulos, G, Enver, T (1989) Simultaneous purification of DNA and RNA from small numbersof eukaryotic cells. Anal Biochem 180(2): 303-306.
    CrossRef
  14. Li X, Jin F, Lee HJ, Lee CJ (2020) Recent Advances in the Development of Novel Drug Candidates for Regulating the Secretion of Pulmonary Mucus. Biomol Ther 28: 293-301.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  15. Park SJ, Kang SY, Kim NS, Kim HM (2002) Phosphatidylinositol 3-kinase regulates PMA-induced differentiation and superoxide production in HL-60 cells. Immunopharmacol Immunotoxicol 24(2): 211-226.
    Pubmed CrossRef
  16. Hong DH, Petrovics G, Anderson WB, Forstner J, Forstner G (1999) Induction of mucin gene expression in human colonic cell lines by PMA is dependent on PKC-epsilon. Am J Physiol 277: G1041-G1047.
    Pubmed CrossRef
  17. Hewson CA, Edbrooke MR, Johnston SL (2004) PMA induces the MUC5AC respiratory mucin in human bronchial epithelial cells, via PKC, PMA/TGF-alpha, Ras/Raf, MEK, ERK and Sp1-dependent mechanisms. J Mol Biol 344(3): 683-695.
    Pubmed CrossRef
  18. Ishinaga H, Takeuchi K, Kishioka C, Suzuki S, Basbaum C, Majima Y (2005) Pranlukast inhibits NF-kappaB activation and MUC2 gene expression in cultured human epithelial cells. Pharmacol 73(2): 89-96.
    Pubmed CrossRef
  19. Li JD, Dohrman AF, Gallup M, Miyata S, Gum JR, Kim YS (1997) Transcriptional activation of mucin by Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide in the pathogenesis of cystic fibrosis lung disease. Proc Natl Acad Sci USA 94(3): 967-972. Authors’ Positions
    Pubmed KoreaMed CrossRef


December 2022, 66 (6)
Full Text(PDF) Free

Social Network Service
Services

Cited By Articles
  • CrossRef (0)