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Evaluation of Anti-cancer Efficacy of Potassium Usnate using NIR Imaging of Orthotopic Breast Cancer Mouse Model
Yakhak Hoeji 2022;66(5):278-282
Published online October 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Yeseon Son*, Changwook Lee*, In Tag Yu**, Mijin Lee*, and Hangun Kim*,#

*College of Pharmacy, Sunchon National University
**CELLGENTEK Co., Ltd.
Correspondence to: Hangun Kim, College of Pharmacy, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si, Jeollanam-do, Republic of Korea
Tel: +82-61-750-3761, Fax: +82-61-750-3708
E-mail: hangunkim@sunchon.ac.kr
Received October 7, 2022; Revised October 25, 2022; Accepted October 27, 2022.
Abstract
Mouse cancer models are useful tools for evaluating in vivo tumor growth and metastasis, providing valuable information for preclinical testing. In this process, optical imaging enables the mouse models to easily identify the progress of disease in a non-invasive way. Here, we established an experimental bioimaging animal model of near-infrared (NIR) fluorescence by using a fluorescence-labeled organism bioimaging instrument (FOBI) and evaluated the anti-cancer effect of potassium usnate (KU) in an orthotopic breast cancer model. The cell viability assay revealed that KU had cytotoxicity with half maximal inhibitory concentration of approximately 138.57, 167.69, and 144.17 μM in 4T1-Fluc-Neo/iRFP-Puro (4T1-iRFP), MDA-MB-231, and MCF-7 cells, respectively. The measurement of NIR fluorescence from the 4T1-iRFP cells in a microtube via FOBI exhibited a strong correlation between cell number and fluorescence intensity, and the minimal detection limit was 105 cells. Accordingly, NIR imaging was performed on the orthotopic breast cancer mouse model by using FOBI, and regression of tumor progression through intraperitoneal KU administration was successfully monitored. Our results demonstrated the establishment of NIR imaging in the orthotopic breast cancer animal model for evaluating the anti-cancer effect of KU.
Keywords : Breast cancer, 4T1 cell, Orthotopic breast cancer mouse model, Potassium usnate
서 론(Introduction)

유방암은 전 세계적으로 발병률이 빠르게 증가하는 질환으로 우리나라에서도 2019년 기준 전체 여성암의 20.6%를 차지할 만큼 여성에서 발생하는 암중 가장 흔한 암이다. 또한 유방암은2019년 국내 암 사망자중 3.3%를 차지하며 7번째로 높은 사망자수를 기록했다.1) 유방암의 발병 요인에는 호르몬, 유전자, 환경적 요인이 작용하며 가족력, 임신 경험, BRCA1,2 유전자의결함 등이 있다.2)

전체 유방암 환자 중 5% 미만이 전이성 유방암으로 처음 진단받지만, 근치적 치료를 받은 환자 중 약 40%에서 재발하며 주로 인체의 핵심 장기인 뇌, 뼈, 간, 폐, 림프절, 늑막 등에 전이된다.1) 조기 유방암의 경우 5년 생존율은 90% 이상이지만, 전이성 유방암은 22%에 불과하다. 전이성 유방암 환자의 기대 여명 또한 2년 미만으로 매우 불량한 예후를 가지며, 특히 간이나 뇌 등으로 전이될 경우 기대 여명은 6개월 이하로 단축된다.3)

전이 과정은 암이 발생한 부위에서 종양세포가 혈관과 림프관으로 침윤하게 되어 혈액과 림프를 따라 순환하다가 특정 부위 조직으로 침투하고 정착하여 증식하는 것이다. 많은 연구자들이 전이 과정의 세부 단계를 이해하기 위한 in vitro, in vivo실험을 진행하고 있으며, 전이 암에 대한 효과적인 치료법을 개발하기 위해 노력하고 있다.3, 4)

In vitro 실험은 주로 전이 부위의 암세포를 분리하여 기저막을 통한 침투나 내피세포에 특이적 결합이 가능한지 확인하는 연구에 사용되므로, 전이 부위에서 국소 환경 내 구성성분 간의 상호작용에 해당하는 전이 과정과 증식 과정을 정확하게 실험하는 것은 불가능하다.5) 그러므로 인체에서 발생하는 종양의 진전과 전이 과정을 재현할 수 있는 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 매우 중요하다.6)

동물 모델을 이용해 치료효과를 평가하기 위해서는, 약물의 투여 전후 질병의 변화를 쉽게 확인하는 것이 중요하다. 이를 위해 최근에는 광학 영상화(optical imaging)가 가능한 동물 모델을 형성하여 질병의 진행 과정을 확인한다. 동물 모델의 광학영상화는 질병의 변화 양상을 비침습(non-invasive)적으로 파악하고 실험동물 한 마리로 실험을 계속 진행하며 변화 양상을 관찰할 수 있다는 장점이 있다.7-10)

우스닉산 칼륨염(Potassium Usnate; KU)은 물에 대한 용해도와 암 조직에서의 생체이용률을 우스닉산(Usnic acid)보다 증가시킨 우스닉산의 염 형태이다. KU는 in vitro, in vivo 실험을 통해 대장암에 대한 종양의 성장, 침윤, 전이를 억제함이 밝혀져있다.11-13) KU의 다양한 생리활성에 관한 연구들이 최근 주목받고 있으며, 본 연구에서는 동소이식 유방암 모델을 제작하고 비침습적인 광학 영상화를 통해 유방암에 대한 KU의 항암 활성을 알아보고자 한다.

방 법(Methods)

세포배양

인간 유방암 세포 MCF-7, MDA-MB-231은 10% Fetal bovine serum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin solution을 포함하는Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)에서 배양했다. BALB/c 마우스 유방암 세포 4T1-Fluc-Neo/iRFP-Puro는 10%FBS, 1% Penicillin-Streptomycin solution, G418 0.1% (#ant-gn-1, InvivoGen, CA, USA), Puromycin 0.02% (#ant-pr-1, InvivoGen, CA, USA)을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양했다.

세포 생존율 분석

MCF-7, MDA-MB-231, 4T1-Fluc-Neo/iRFP-Puro 세포에 대한우스닉산 칼륨염(potassium usnate, KU)의 세포 생존율 영향은3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 사용하는 발색분석법을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 3.0×103 cells/well로 세포를 분주하고 24시간 동안 CO2 배양기에서 배양한다. KU를 농도별로(100, 50, 25, 12.5 µM) 처리한배지로 갈아준 후, 48시간 동안 배양하였다. 이 때 대조군은 KU 처리군과 동일 농도의 DMSO를 처리하였다. MTT reagent (Sigma, USA)를 최종 농도 0.5 mg/mL로 각 well에 첨가하고 37°C에서 4시간 반응시킨 뒤, 배지를 제거하고 DMSO 100 µL/well을 처리하였다. Gen 5 (2.03.1) software (BioTek Eon, USA)를 사용하여540 nm에서 흡광도를 분석하였다. 각 실험에 대해 3회에 걸쳐 측정하여 그 평균값과 표준오차를 최종 값으로 세포 생존율(cell viability)을 계산하였다.

In vitro iRFP 세포 근적외선 이미징

BALB/c 마우스 유선 조직(mammary gland tissue)으로부터 유래한 4T1 세포주 중 근적외선 영역의 형광을 내는 iRFP를 가지는 4T1-Fluc-Neo/iRFP-Puro (4T1-iRFP) cell을 동물 모델에 접종하기 전, NIR 이미징을 통해 정량 한계를 측정한다. 세포 현탁액의 NIR 정량을 위해 0.2 mL PCR tube에 세포 수에 따라 담은 후, 형광 in vivo 이미징 시스템(fluorescence-labeled organism bioimaging instrument, FOBI) 장비로 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정했다.

동소이식 유방암 모델 제작 및 in vivo 근적외선 이미징

‘Guiding principles in the care and use of animals (DHEW publication, NIH, 80-23)’에 따라 동물 실험을 진행하였다. 병원체에 노출되지 않은 5주령의 암컷 BALB/c 마우스(Orient Company, Seongnam, Korea)에는 실험 전반에 걸쳐 체내 분변의 형광 감소를 위해 alfalfa-free 식이(Imanis Life Sciences, MN, USA)를 공급하였다. RPMI-1640 배지에서 배양된 4T1-iRFP cell을 접종전 Nikon Eclipse 400 fluorescence microscope으로 촬영하여 형광 유무를 확인한다. 동물실험실에서 1주일 동안 적응기를 거친 마우스를 Avertin으로 마취하였다. Avertin은 2,2,2-tribromoethyl alcohol과 2-Methyl-2-Butanol을 pH 7의 증류수에 혼합하여 40°C에서 90분 동안 용해하고, 이후 0.25 μm 필터로 여과하여 제조하였으며, 4°C에서 냉장 보관된 것을 제조일로부터 14일 이내에 사용하였다. 마취된 마우스의 왼쪽 유선 조직 부위(abdominal/inguinal mammary gland)를 ethanol로 소독한 후 절개하였다. 유선 조직 지방층(mammary fat pad)을 핀셋으로 잡고 PBS에 현탁한 4T1-iRFP cell을 2.5×105 만큼 주사한 뒤, 다시 봉합하였다.출혈이 있는 경우 PBS로 세척하였으며, 이후 오른쪽도 동일하게 수행하였다. 세포 접종 8일 후(day 8), 양측 종양 크기를 고려하여 두 그룹으로 나누어 약물을 주 3회 처리하였다. 실험군(n=4)에는 KU를 마리 당 20 mg/kg (100 μL) 복강내 주사하였고,대조군(n=4)에는 동일 부피의 PBS를 복강내 주사하였다. 유방암마우스 모델에 약물을 주 3회 처리함과 동시에 냉장보관 한Avertin을 200 mg/kg 복강 내로 주사하여 FOBI 장비로 형광 강도를 측정했다. 가시광선과 NIR 영역에서 촬영한 이미지를 통해 종양 성장을 평가하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

우스닉산 칼륨염에 의한 4T1과 MCF-7, MDA-MB-231의 세포독성 평가

유방암 세포 MCF-7, MDA-MB-231 (human), 4T1-iRFP (mouse)에 DMSO와 KU를 농도별로 처리한 후, MTT assay를 통해 유방암 세포 생존율(Cell viability)을 측정하였다. KU에 대한 IC50는 각각 4T1-iRFP 138.57 μM, MDA-MB-231 167.69 μM, MCF-7 144.17 μM이다(Fig. 1A-B).



Fig. 1. MTT assay. KU inhibits 4T1 (mouse) and MCF-7 (human) cell viability in a dose-dependent manner. (A) Three different BC cells (4T1-iRFP, MDA-MB-231, MCF-7) were seeded in 96-well plates, and after 12h, they were treated with KU concentrations (12.5, 25, 50 and 100 μM) for 48 h. The cell viabilities were measured by MTT assays. (B) Calculated IC50 values in response to treatment with KU.

대장암을 이용한 선행연구에서 나타난 HCT116 86.86 μM, SW620 32.32 μM, CT26 35.321 μM의 IC5012)에 비해 유방암 세포의 IC50는 높은 값을 보였다.14)

In vitro NIR cell imaging

소동물 생체 형광 신호 분석 전용 NIR 이미징 시스템을 갖춘 FOBI 장비로 4T1-iRFP cell의 형광 유무를 확인하고 세포 수에 따른 형광 강도 그래프를 얻을 수 있었다. 세포 수에 따른형광 강도는 다음의 계산식 1을 이용하여 계산하였다. 계산한 값을 정량 수치화한 결과, 세포 수에 따른 형광 강도 직선 그래프를 얻을 수 있었다(Fig. 2A-B). 4T1-iRFP cell의 세포수에 따른 FOBI 장비의 형광 검출한도를 그래프로 나타내었다(Fig. 2C-D).



Fig. 2. NIR fluorescence of 4T1-iRFP cells in FOBI. (A) In vitro FOBI imaging of cell suspension in Eppendorf PCR Tube (200 μL) under the FOBI imaging system. (B) Quantitative analysis of Red channel-NIR signals from the FOBI imaging. (C) In vitro FOBI imaging of 4T1-iRFP cell pellet (D) Quantitative analysis of NIR signals from the FOBI imaging.

[계산식 1]

Intergrated Density = 면적×IU (Intensity/Min/Gain)

in vivo NIR imaging

마우스에 4T1-iRFP cell을 접종한지 8일 후(day 8), NIR 이미징을 통해 접종 부위의 형광 유무를 확인하고 동소이식 유방암모델을 확립하였다. 이후 실험군과 대조군으로 나뉜 두 그룹에7일 동안 주 3회 약물을 처리하며 FOBI 장비로 촬영한 결과, KU 처리한 실험군(n=4)이 대조군(n=4)에 비해 종양 크기가 30%정도 감소함을 확인하였다(Fig. 3).



Fig. 3. Orthotopic BC Mouse Model NIR intensity. KU suppressed tumor growth in an orthotopic 4T1 BC model. Mice were inoculated with 4T1-iRFP cells into mammary gland and treated with PBS (control), KU (20 mg/kg/mouse three times a week) for 15 days. (n=4 mice per group) (A) Representative images of in vivo FOBI imaging results in mice inoculated with 4T1-iRFP cells. (B) Quantitative analysis of signals from the FOBI imaging.

선행연구에서 우스닉산은 폐암세포의 운동성을 억제함이 입증되었으며, KU는 대장암의 침윤과 전이를 억제함이 입증되었다.11, 15) 이번 연구를 통해 KU가 유방암에서도 세포 독성을 가지고 있음을 확인하였고, 동소이식 유방암 모델에서 종양 성장을 억제한 것을 통해 항암제로서 KU의 잠재적 적용 가능성이 확인되었다.

결론(Conclusion)

동물실험은 종양의 성장과 전이에 관해 실제와 유사한 환경을 제공하여 항암 효과를 갖는 약물의 효과를 평가하는데 유용하게 사용된다.16) 본 연구에서는 유방암이 림프절, 폐, 뼈, 뇌 등으로 전이되는 과정을 연구할 수 있는 동물 모델을 수립하고자 하였다.

암세포를 피하로 주입하는 기존 피하 종양 모델의 경우, 암세포가 유래한 장기가 아닌 조직에서 암이 유발되므로 동물실험에서 나타난 결과가 이후 실험결과와 연결되지 않는 경우가 빈번했다. 동소이식 유방암 모델은 암세포가 유래한 장기에 종양을 발생시키는 동물 모델로서 기존 모델의 단점을 극복할 수 있다. 그러나 동소이식 유방암 모델은 세포 주입량, 주사 위치 선정에 따라 암세포의 생착률이 달라지기 때문에 관찰과 정량이 어려운 단점이 있다.17)

이번 연구에서는 NIR 형광 단백을 갖는 유방암 세포를 NIR 이미징 장비로 촬영하여 in vitro 환경에서 세포의 수에 따른 형광 세기 그래프를 그릴 수 있었다. NIR 세포를 동소이식한 in vivo 유방암 종양 마우스 모델을 FOBI 장비로 촬영하여 종양부위의 형광을 측정하였다. 이후 in vivo 이미징을 통해 측정한 종양의 형광세기를 in vitro 이미징 실험에서 얻은 세포수와 형광세기의 그래프와 비교하여 정확한 종양의 크기를 결정할 수 있었다.

NIR 이미징을 통한 Orthotopic Breast Cancer Mouse Model (동소이식 유방암 모델) 분석으로 이전 연구들에서 대장암에 종양 억제 효과를 나타낸다고 알려진 우스닉산 칼륨염(Potassium usnate, KU)이 유방암에 대해서도 종양 억제 효과를 나타냄을 새롭게 알 수 있었다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 연구는 2020년 순천대학교 학술연구비 공모과제 및 한국연구재단 과제(NRF-2020R1C1C1007832)로 연구되었으며, 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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