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Involvement of Intracellular Ca2+ and Nitric Oxide in the Hydroxyurea-Induced Melanogenesis
Yakhak Hoeji 2022;66(5):242-248
Published online October 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Yong Soo Lee#

College of Pharmacy, Duksung Women's University
Correspondence to: Yong Soo Lee, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea
Tel.: 02-901-8396 Fax.: 02-901-8386
E-mail: yongslee@duksung.ac.kr
Received August 23, 2022; Revised September 21, 2022; Accepted September 30, 2022.
Abstract
The molecular mechanism underlying hyperpigmentation as an adverse side effect of the anticancer drug, hydroxyurea (HU), was investigated in B16 melanoma cells. HU increased the melanin content and intracellular Ca2+ concentration in a dose-dependent manner. These effects were significantly reduced by treatment with the intracellular Ca2+ release blockers, dantrolene and 2-aminoethoxidiphenylborate (2-APB). Additionally, HU induced the production of nitric oxide (NO) in a time- and dose-dependent manner, and this was significantly blocked by inhibitors of the increase in intracellular Ca2+ levels(bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester, dantrolene, and 2- APB). Furthermore, the HU-induced increases in NO and melanin production were significantly suppressed by NG-nitro-L-arginine methyl ester and 2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide, an NO synthase inhibitor and an NO scavenger, respectively. These results suggest that HU-induced melanogenesis through NO and an increase in intracellular Ca2+ levels may be involved in the mechanism of its hyperpigmentation effect.
Keywords : B16 melanoma cell, Hydroxyurea, Hyperpigmentation, Intracellular Ca2+, Melanogenesis, Nitric oxide
서 론(Introduction)

사람의 피부색은 주로 두 가지 형태의 멜라닌, 즉 유멜라닌(eumelanin)과 페오멜라닌(pheomelanin)에 의해 결정되며, 그 외 피부에 존재하는 모세혈관의 수, 카로테노이드(carotenoid)나 라이코펜(lycopene) 등 혈액에 포함되어 있는 발색단과 진피층에 존재하는 콜라겐(collagen)의 함량도 중요한 결정 요소로 작용한다.1) 피부의 색이 어두워지는 과색소침착(hyperpigmentation)은 대부분 표피나 진피층에 멜라닌 침착이 증가하는 멜라닌과다증(hypermelanosis)에 의해 발생하며, 그 외 비멜라닌 발색단, 철, 중금속 등 내·외인성 색소의 침착에 의해 일어나기도 한다.2) 과색소침착은 흔하게 볼 수 있는 피부 증상으로 외모에 좋지 않은 영향을 줌으로써 사람의 삶의 질을 저하시키는 원인으로 작용하기도 한다.3)

과색소침착은 유전질환, 염증, 외상, 일광 노출, 약물 등 다양한 원인에 의해서 발생할 수 있다.4) 이 중 약물에 의한 과색소침착은 특정한 약물을 투여할 때 일어나는 것으로 후천적 과색소침착의 10-20%를 차지하며 특히 노인에게서 잘 발생한다.5) 피부색의 변화는 약물치료 후 천천히 일어나다 갑자기 넓게 퍼지고 수개월 또는 수년에 걸쳐 악화되며 태양에 노출되는 부분 또는 구강 및 결막과 같은 점막에서 잘 일어나는 특징을 가지고 있다.5) 약물-유도성 과색소침착에 의한 피부색은 종종 특이한 보라색을 띄는데 클로파지민(clofazimine)에 의해서는 적황색으로, 향정신성 약물이나 아미오다론(amiodarone) 및 금속에 의해서는 청회색으로 나타나는 경우도 있다.6)

과색소침착을 일으키는 주원인 물질인 멜라닌은 멜라닌세포의 멜라닌소체에 존재하는 여러 효소들에 의해서 합성되는데, 그 중 티로시나제(tyrosinase)가 율속 효소로 작용한다.7) 멜라닌 합성을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로로 특히, 티로시나제의 활성에 영향을 미치는 것으로서 protein kinase C-β (PKC-β)8) 및 cAMP9)가 잘 알려져 있다. 또한, 산화질소10) 및 세포 내 칼슘11)도 멜라닌 생성과정에 관여하는 중요한 신호로 여겨지고 있다. 이 중 산화질소는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase; NOS)에 의해 생성되는데,12) 이 효소는 실제 피부세포에서도 존재하며,13) 자외선 조사에 의한 멜라닌 생성 촉진작용에 그 아형인 기본구성(constitutive) 산화질소 합성효소(cNOS)가 관련되어 있다는 사실이 보고된 바도 있다.14) 산화질소는 세포 내에서 guanylyl cyclase를 거쳐 cGMP-dependent protein kinase (PKG)의 활성화를 유도하는데, PKG는 직접적으로 티로시나제의 활성화를 통하여 멜라닌 합성작용에 관여하는 것으로 알려지고 있다.14) 또한, 산화질소는 티로시나제의 발현을 증가시키는 전사인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 인산화를 통하여 멜라닌 합성을 촉진한다는 보고도 있다.15)

히드록시우레아(hydroxyurea)는 암세포에 대하여 DNA 합성을 억제하는 작용을 나타내는 항암약물로서 만성골수성백혈병에 대한 일차 치료제로 사용되고 있고, 기타 방광암, 유방암, 흑색종, 위암, 대장암 및 간암 등의 암종에도 사용되고 있다.16) 히드록시우레아로 치료받는 환자에게서 과색소침착, 건피증(xerosis), 피부궤양, 피부근염 등 피부 부작용이 특히 많이 관찰된다.17) 흥미롭게도, 히드록시우레아가 세포 내 칼슘 및 산화질소의 생성을 증가시키는 것으로 보고된 바 있는데,18) 이 신호들은 멜라닌 합성과정에 연루되어 있다고 알려져 있다.10,11)

본 연구에서는 지금까지 밝혀진 결과들을 바탕으로 하여 히드록시우레아에 의해 유발되는 피부 부작용인 과색소침착이 세포 내 칼슘 및 산화질소의 증가로 인한 멜라닌의 과생성에 의해 일어난다고 가정하고 이를 규명하고자 하였다.

방 법(Methods)

시약

2-Aminoethoxidiphenylborate (2-APB), bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester (BAPTA/AM), 2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide(cPTIO), 4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2 DA), dantrolene(Dant), 1-(2,5-carboxyoxazol-2-yl-6-aminobenzfuran-5-oxyl)-2-(2'-amino-methylphenoxy)-ethane-N,N,N'N'-tetraacetoxylmethylester (Fura-2/AM), hydroxyurea (HU), NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME), melanin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 및 그 외 각종 용매와 세포 배양에 필요한 시약은 Sigma-Aldrich (미국)에서 구입하였다.

세포 배양

B16 흑색종 세포는 서울대학교 한국세포주은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 10% fetal bovine serum과 penicillin (100 IU/mL) 및 streptomycin (50 μg/mL)을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium 용액으로 37°C로 유지되는 5% CO2 배양기(Forma, 미국)에서 배양하였다.

세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 이전 본 연구실에서 발표한 논문에서와 동일한 방법으로 시행하였다.19) 간단히 설명하면, B16 세포를 24 well plate에서 48시간 동안 배양한 후 MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 반응시켜 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시켜 540 nm에서 ELISA reader (Molecular Device, 미국)로 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.

멜라닌 정량

멜라닌 정량은 이전 본 연구실에서 발표한 논문에서와 동일한 방법으로 시행하였다.19) 간단히 설명하면, B16 세포에서 24 well plate에 세포를 부착시킨 후 약물을 처리하고 48시간 뒤 세포를 균질 완충액으로 용해시킨 후, 세포 pellet을 녹인 다음 96 well plate에 옮겨 ELISA reader (Molecular Device, 미국)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 생성량은 멜라닌 표준품을 이용한 표준 검량선을 이용하여 산출하였고 대조군과 비교하여 배수 증가(fold increase)로 나타내었다.

세포 내 칼슘 이온 농도 측정

세포 내 칼슘 이온 농도는 이전 본 연구실에서 발표한 논문에서와 동일한 방법인 형광 침탐법(fluorescent probe method)을 이용하여 측정하였다.19) 간단히 설명하면, B16 세포에 Fura-2/AM을 가해 배양한 후 세포를 수집하여 Krebs-Ringer 완충액에 현탁시켜 Hitachi F-4500 형광분석기(Hitachi Inc, 일본)를 사용하여 340 및 380 nm에서 여기 시킨 후 발광하는 형광을 510 nm에서 측정하였다. 세포 내 칼슘 농도는 340:380 nm 형광비 값을 구한 후 대조군과 비교하여 배수 증가(fold increase)로 나타내었다.

산화질소(nitric oxide) 측정

산화질소의 측정은 이전 발표한 논문에서와 동일한 방법인 DAF 형광법을 사용하였다.19) 간단히 설명하면, 세포를 검정색 96-well plate에 48시간 동안 배양시킨 후 L-arginine (10 μM)을 포함하는 용액에서 25분간, DAF-2 DA (10 μM)를 가해 30분간 더 방치한 후 여기-발광(각각 485 및 535 nm) 파장을 이용하여 발생되는 형광을 fluorescent plate reader (BMG technologies, 미국)로 측정하였다. 세포 내 산화질소 농도는 각 형광값을 구한 후 대조군과 비교하여 배수 증가(fold increase)로 나타내었다.

자료 분석 및 통계적 검정

모든 실험은 네 번 반복해서 실시하고 실험 결과는 대조군의 조건에 대한 백분율 또는 배수 증가로 나타내었다. 실험 결과는 평균값±SEM으로 표시하고 ANOVA로 분석하며 각각의 유의성 비교는 Student-Newman-Keul’s test를 이용하여 실시하였다. P값이 0.05 이하인 경우에만 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

세포 생존율에 미치는 히드록시우레아의 효과

B16 흑색종 세포에 대한 히드록시우레아의 독성을 알아보기 위하여 MTT 분석을 시행하였다. 히드록시우레아는 20 μM 까지는 세포 생존율에 대하여 통계적으로 유의성 있는 변화를 초래하지 않았으나 50 μM 이상의 농도에서는 독성을 나타내었다(Fig. 1). 따라서 이후의 모든 실험에는 세포 생존율의 감소로 인해 발생할 수 있는 실험 결과에 대한 간섭 효과를 배제하기 위하여 세포 생존율에 영향을 주지 않는 20 μM 이하의 농도에서 히드록시우레아를 사용하였다.



Fig. 1. Effects of HU on cell viability in B16 melanoma cells. Cell viability assay was done after cells were incubated with or without each concentration of HU for 48 hr. Results are expressed as a percentage of control condition in which cells were grown in medium without HU. Each column represents the mean value of four replications with bars indicating SEM. *P<0.05 compared to negative control. Abbreviations: HU, hydroxyurea.

히드록시우레아에 의한 멜라닌 생성 촉진 효과

B16 세포에서 히드록시우레아의 멜라닌 합성에 대한 효과를 조사하였다. 히드록시우레아를 가하고 생성된 멜라닌이 분석이 가능한 정도가 되는 48시간 동안 배양한 후 세포를 수집하여 멜라닌 양을 측정한 결과, 히드록시우레아는 농도-의존적으로 멜라닌 합성을 증가시켰는데, 5, 10 및 20 μM 농도 처리군에서 대조군에 비해 멜라닌 합성이 각각 약 2.1, 2.9 및 3.1배 증가하여 통계적으로 유의한 촉진 효과를 나타내었다(Fig. 2). 본 연구실의 조사로서는 아직까지 멜라닌 합성에 미치는 히드록시우레아의 직접적인 효과에 대한 연구결과는 보고된 바가 없다.



Fig. 2. 2. Effects of HU on melanin synthesis in B16 melanoma cells. Melanin content was measured after the cells were incubated with each concentration of HU for 48 hr. In the data melanin contents are expressed as a fold increase compared to control condition in which the cells were incubated with HU-free medium. Each column represents the mean value of four replications with bars indicating SEM. *P<0.05 compared to negative control. Abbreviations: HU, hydroxyurea.

히드록시우레아-유도 멜라닌 생성에 미치는 칼슘의 역할

본 연구실의 이전 연구에서 세포 내 칼슘이 멜라닌 합성과정에 연루되어 있다는 사실을 밝힌 바 있다.20) 또한, 다른 연구에서 히드록시우레아가 세포 내 칼슘 농도를 증가시킨다는 사실이 보고된 바 있기 때문에18) 본 연구에서는 세포 내 칼슘이 히드록시우레아-유도 멜라닌 합성에 중요한 매개체로 작용할 것으로 가정하고 이를 규명하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.

Fura-2 형광법을 이용하여 세포 내 칼슘 농도를 측정한 결과 히드록시우레아(20 μM)는 세포 내 칼슘 농도를 빠르게 증가시켰는데(Fig. 3A), 이 작용은 농도-의존성을 보였으며, 10 및 20 μM 농도에서 세포 내 칼슘을 각각 약 1.85 및 2.1배로 통계적으로 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 3B). 이러한 히드록시우레아의 세포 내 칼슘 증가 작용은 세포 내에서 칼슘 유리를 일으키는 통로인 ryanodine 및 1,4,5-trisphosphate (IP3) 수용체에 대한 길항제로 작용하는 Dant (50 μM) 및 2-APB (100 μM)의 전처리에 의해 유의성 있게 억제되었다(Fig. 3A 및 3B). 또한, 세포 내 칼슘 유리 억제제(Dant 및 2-APB) 및 세포 내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM (1 μM)을 처리한 결과, 히드록시우레아-유도멜라닌 합성이 유의성 있게 차단되었다(Fig. 3C). 이 결과들로 미루어보아 히드록시우레아-유도 멜라닌 합성은 세포 내 칼슘에 의해 매개된다고 추측된다.



Fig. 3. Involvement of intracellular Ca2+ release in the HU induced stimulation of melanin synthesis in B16 melanoma cells. The data (A) represent intracellular Ca2+ changes with time. The arrow shows the time point for addition of HU (20 μM). Dant (50 μM) and 2-APB (100 μM), inhibitors of ryanodine and IP3 receptors, respectively, were added 10 min before treatment with HU. In the data (B) and (C), quantitative changes in intracellular Ca2+ concentrations ([Ca2+]i) and melanin contents, respectively, are expressed as a fold increase compared to negative control. BAPTA/AM (1 μM), an intracellular Ca2+ chelator, was used in the experiments. In these data, each column represents the mean value of four replications with bars indicating SEM. *P<0.05 compared to negative control. #P<0.05 compared to HU alone. Abbreviations: 2-APB, 2-aminoethoxidiphenylborate; BAPTA/AM, bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester; Dant, dantrolene; HU, hydroxyurea.

아직까지 멜라닌 합성을 매개하는 세포 내 칼슘의 역할에 대한 정확한 분자 기전은 분명하지 않지만, 세포 내 칼슘과 멜라닌 합성과의 연관성은 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다. 멜라닌 합성을 증가시키는 요인으로 잘 알려진 자외선의 조사는 세포 내 칼슘 농도를 증가시키며 이들 사이에는 상호 연관성이 존재한다는 것이 보고되었다.21) 또한, 멜라닌 합성에 관여하는 주효소인 티로시나제를 인산화하여 그 활성을 증가시키는 인자로 protein kinase C-β (PKC-β)22)가 있는데, 이 효소의 활성은 칼슘이온의 증가에 의존성을 보이므로,23) 궁극적으로 세포 내 칼슘 증가는 티로시나제의 활성화를 통해 멜라닌 합성을 유도할 수 있을 것이다. 다른 한편으로, 칼슘 이온은 세포 내에서 멜라닌 합성과 저장이 일어나는 장소인 멜라노좀에 작용한다. 멜라노좀에는 칼슘 이온이 농축되어 있고 칼슘 저장고로 작용하는데,24) 그 이유는 멜라닌은 칼슘 이온과 결합하고 킬레이트를 형성할 수 있기 때문이다.25) 만약 세포 내 칼슘 이온이 증가되면 멜라노좀의 막에 존재하는 칼슘 펌프를 통해 칼슘 이온이 멜라노좀의 내강으로 들어가 결국 멜라노좀의 막전압과 내강 pH의 변화를 유발하게 되는데 이 현상은 멜라닌 합성에 필요한 효소들의 활성을 유도한다고 알려져 있으므로,26) 궁극적으로 멜라닌 합성을 촉진하는 결과를 가져올 수 있을 것이다. 하지만, 세포 내에서 칼슘 이온은 여러 신호 전달 체계에 연루되어 있기 때문에 위에서 언급한 기전 외에 다른 하위 신호의 작용으로 멜라닌 합성이 유도될 수 있다는 점을 배제할 수는 없다. 따라서 다음 연구로 세포 내 칼슘 이온 증가에 의해 활성화되는 효소의 일종인 구성산화질소합성효소12)에 의해 생성되는 산화질소가 히드록시우레아-유도 멜라닌 합성에 중요한 역할을 담당하고 있다고 가정하고 이를 규명하기 위한 실험을 진행하였다.

히드록시우레아-유도 멜라닌 생성에 미치는 산화질소의 역할

세포 내로의 칼슘 이온 유리는 그 활성이 칼슘에 의존적인 구성산화질소합성효소를 자극하여 산화질소를 생성시킬 수 있고,12) 또한 산화질소는 멜라닌 합성과정에 중요한 매개체로 작용한다는 사실이 알려져 있으므로,15) 본 연구에서는 히드록시우레아-유도 멜라닌 생성에 산화질소가 연루되어 있다고 가정하고 이를 규명하고자 하였다. 히도록시우레아는 농도 의존적으로 산화질소의 생성을 증가시켰으며(Fig. 4A) 비선택적인 산화질소합성효소 억제제인 L-NAME (100 μM)와 생성된 산화질소를 제거하는 약물인 cPTIO (100 μM)를 전처리한 군에서 히드록시우레아(20μM)에 의한 산화질소의 생성(Fig. 4B)과 멜라닌 합성(Fig. 4C)이 통계적으로 유의성 있게 감소되었다. 이 결과는 히드록시우레아-유도 멜라닌 생성에 산화질소가 매개체로 관여하고 있다는 사실을 의미한다. 마지막으로, 히드록시우레아에 의한 산화질소의 생성이 유리된 세포 내 칼슘에 의한 것인지를 확인하기 위하여 산화질소의 생성에 미치는 세포 내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM (1 μM)과 세포 내 칼슘 유리 억제제인 Dant 및 2-APB의 영향을 관찰하였다. 실험 결과에서 이들 억제제를 전처리한 군에서 히드록시우레아-유도 멜라닌 합성이 유의성 있게 차단되었다(Fig. 5). 따라서 이 결과들을 종합해 보면, 히드록시우레아에 의한 멜라닌 합성은 순차적으로 세포 내 칼슘 유리에 의해 구성 산화질소합성효소의 활성화가 유발되고 이를 통해 생성된 산화질소에 의해 일어난다고 추측된다. 본 연구에서 사용한 동일한 세포인 B16 흑색종 세포를 이용한 다른 연구에서도 transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1)이온 통로를 통해 유입된 칼슘 이온이 구성산화질소합성효소를 활성화시켜 산화질소의 생성을 유발하고 결과적으로 멜라닌 합성을 유도한다는 사실이 보고되었다.20) 멜라닌 합성을 유발하는 자외선 조사14)나 멜라닌세포자극호르몬(α-melanocyte stimulating hormone)27)에 의해 산화질소의 생성이 촉진되며, 인삼 뿌리 추출물인 vanillic acid28) 및 비타민 C29)에 의한 멜라닌 생성 억제 작용이 산화질소의 생성 억제와 관련이 있다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 멜라닌 합성에 관여하는 산화질소의 작용기전은 아직 확실하지는 않지만, guanylyl cyclase 및 cGMP-dependent protein kinase (PKG)의 활성화를 통해 멜라닌 합성에 필수적인 효소인 티로시나제(tyrosinase)를 직접 활성화하거나14) 그 발현을 증가시켜11) 멜라닌 합성을 유도할 것으로 판단된다. 또한, 산화질소에 의한 cGMP/PKG 활성화 다음의 하위 신호로 microphthalmia-associated transcription factor(MITF)의 인산화가 유도되며 인산화된 MITF는 바로 티로시나제의 발현을 증가시키거나,15) 또는 PKC-β의 발현을 증가시킴으로써 이에 민감한 티로시나제의 활성을 높여30) 궁극적으로 멜라닌 합성을 촉진할 것으로 생각된다.



Fig. 4. Role of NO in the HU-mediated melanogenesis in B16 melanoma cells. Data (A) represent NO production as a function of time. In the data (B) and (C), quantitative changes in [NO] and melanin contents, respectively, are expressed as a fold increase compared to negative control. In these experiments L-NAME (100 μM) and cPTIO (100 μM) were used as a NOS inhibitor and a NO scavenger, respectively. These drugs were added 30 min before HU (20 μM) application. Data points and columns represent the mean value of four replications with bars indicating SEM. *P<0.05 compared to negative control. #P<0.05 compared to HU alone. Abbreviations: Con, control; cPTIO, 2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylinidazoline-1-oxyl-3-oxide; HU, hydroxyurea; L-NAME, NG-nitro-L-arginine methyl ester; NO, nitric oxide; NOS, nitric oxide synthase.


Fig. 5. Role of intracellular Ca2+ release in the HU-mediated NO production in B16 melanoma cells. The data represent quantitative changes in [NO] which are expressed as a fold increase compared to negative control. In these experiments BAPTA/AM (1 μM), an intracellular Ca2+ chelator, and 2-APB (100 μM) and Dant (50 μM), blockers of intracellular Ca2+ release, respectively, were used. These drugs were added 30 min before HU (20 μM) treatment. *P<0.05 compared to negative control. #P<0.05 compared to HU alone. Each column represents the mean value of four replications with bars indicating SEM. Abbreviations: 2-APB, 2-aminoethoxidiphenylborate; BAPTA/AM, bis-(o-aminophenoxy)-ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid/acetoxymethyl ester; Con, control; Dant, dantrolene; HU, hydroxyurea; NO, nitric oxide.
결 론(Conclusion)

본 연구에서는 항암제로 사용하는 히드록시우레아의 부작용으로 알려진 과색소침착에 대한 분자 기전을 규명하고자 하였다. 실험 결과에서 히드록시우레아는 B16 세포에서 농도-의존적으로 멜라닌 합성(Fig. 2) 및 세포 내 칼슘 농도를 증가시켰다(Fig. 3A 및 3B). 세포 내 칼슘 유리 억제제로 알려진 Dant와 2-APB를 처리한 결과 히드록시우레아에 의한 세포 내 칼슘 농도의 증가가 유의성 있게 감소하였으며(Fig. 3A 및 3B) 세포 내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM과 Dant 및 2-APB는 히드록시우레아-유도 멜라닌 생성을 유의성 있게 저해하였다(Fig. 3C). 또한, 히드록시우레아는 산화질소의 생성을 시간 및 농도-의존적으로 증가시켰다(Fig. 4A). 이 작용은 산화질소 생성 효소 억제제인 L-NAME와 산화질소 제거제인 cPTIO (Fig. 4B) 및 세포 내 칼슘 유리 억제제(Dant 및 2-APB)와 세포 내 칼슘 킬레이트인 BAPTA/AM에 의해 유의성 있게 차단되었다(Fig. 5). 산화질소의 생성 억제(L-NAME) 및 제거(cPTIO)에 의해 히드록시우레아-유도 멜라닌 생성도 유의성 있는 감소를 보였다(Fig. 4C). 본 연구에서 얻은 결과와 보고된 문헌을 토대로 하여 히드록시우레아-유도 멜라닌 합성에 대한 분자 기전은 다음과 같이 유추해 볼 수 있다(Fig. 6). 히드록시우레아는 소포체(endoplasmic reticulum)의 막에 존재하는 칼슘 유리 통로(ryanodine 및 IP3 수용체)를 활성화하여 소포체로부터 칼슘을 유리시킨다. 증가된 칼슘은 PKC-β를 통하여 티로시나제를 활성화함으로써 멜라닌 합성을 유도할 수 있다.22) 또한, 증가된 칼슘은 구성산화질소합성효소의 활성화를 통하여 산화질소의 생성을 유발한다. 생성된 산화질소는 cGMP/PKG 신호를 경유하여 직접적으로 티로시나제를 활성화시켜14) 멜라닌 합성을 유도한다. 다른 한편으로, 인산화를 통해 활성화된 MITF가 직접 티로시나제의 발현을 증가시켜 멜라닌의 생성을 유도하거나,15) 간접적으로 PKC-β 발현을 증가시켜 티로시나제의 활성을 촉진30)함으로써 멜라닌의 생성을 유도할 수도 있다. 본 연구 결과는 히드록시우레아를 투약받은 환자에게서 나타날 수 있는 피부 부작용인 과색소침착이 세포 내 칼슘 및 산화질소의 증가에 기인한 멜라닌 과생성에 의해 일어날 수 있다는 사실을 시사한다. 이와 더불어, 향후 히드록시우레아에 의한 과색소침착 피부 부작용을 개선하는 치료제 개발 연구에 이러한 세포 내 신호전달 체계를 차단하는 기술이 활용될 수 있을 것으로 기대된다.



Fig. 6. Proposed mechanism of the HU-mediated melanogenesis in B16 melanoma cells. Abbreviations: cNOS, constitutive nitric oxide synthase; ER, endoplasmic reticulum; HU, hydroxyurea; MITF, microphthalmia-associated transcription factor; NO, nitric oxide; PKC-β, protein kinase C-β; PKG, cGMP-dependent protein kinase.
감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 덕성여자대학교 2022년도 교내연구비 지원에 의해 수행되었음.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

References
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October 2022, 66 (5)
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