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Development and Validation of LC-MS/MS Method for Determination of Astaxanthin in Dietary Supplement
Yakhak Hoeji 2022;66(5):236-241
Published online October 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Ji Eun Park and Mi Hyune Oh#

Center for Food & Drug Analysis, Gyeongin Regional Office of Food and Drug Administration, Ministry of Food and Drug Safety, Incheon, Korea
Correspondence to: Mi Hyune Oh, Gyeongin Regional office of Food and Drug Safety, 137, Juan-ro Michuhol-gu Incheon 22133, Korea
Tel: +82-32-450-3325, Fax: +82-32-442-4622
E-mail: mhoh99@daum.net
Received August 19, 2022; Revised September 13, 2022; Accepted September 27, 2022.
Abstract
The Ministry of Food and Drug Safety is amending its test methods for dietary supplements (functional health food) to establish regulatory standards and specifications in Korea. In this regard, we continue to research analytical method development for the items to improve their sensitivity and selectivity. In this study, we have developed liquid chromatographic-tandem mass spectrometry for astaxanthin analysis. This method can be used to characterize and quantify dietary supplement formulations containing astaxanthin. The procedure was validated at 37.5-2,400 ng/mL. Standard calibration curves presented linearity with the coefficient of determination (r 2)>0.999. The limits of detection and limits of quantitation were 16 and 49 ng/mL, respectively. The recovery results ranged between 91.9-97.4% at three different concentration levels with relative standard deviations (RSDs) of less than 3.6%. The precision results (RSDs) were obtained between 1.2-3.5%, and reproducibility (1.8%) was obtained. These are in accordance with the established validation criteria (Association of Official Analytical Chemists). Our research can provide scientific evidence to amend the astaxanthin test method for Health Functional Food Codes.
Keywords : Astaxanthin, LC-MS/MS, Dietary supplement
서 론(Introduction)

국내 건강기능식품 시장은 최근 5년간 연평균 성장률 12.4%의 높은 성장률을 보여 왔으며, 2020년 기준으로 시장규모는 3.1 조원에 달한다.1) 국내 건강기능식품 시장이 지속적으로 커짐에 따라 융복합건강기능식품 개발을 비롯한 제품 유형 및 형태 등도 매우 다양해지고 있는 상황이다. 이에 따라 식품의약품안전처는 우수한 건강기능식품이 제조되고 공급될 수 있도록 하기 위하여 다양한 정책과 제도를 마련하여 시행하고 있다.

이러한 배경하에 식품의약품안전처는 2012년부터 건강기능식품 공전(이하 건기공전) 시험법을 개선해 오고 있으며, 그 결과 질량분석기를 이용하여 20종 이상의 시험법을 도입한 바 있다. 질량분석법은 감도와 특이성이 높은 장점을 이용하여 제품의 규격 관리 및 시장 확대를 비롯한 다양한 제품 공급에 기여할 것으로 기대된다.2)

아스타잔틴은 게, 새우 등 갑각류의 껍질에 함유된 카로티노이드계 적색 색소로 베타카로틴과 유사한 구조이다. 자연계에 존재하는 항산화 물질로, 지아잔틴, 루테인, 칸타크산틴 및 베타카로틴 등에 비해 10배 이상, 비타민 E에 비해 약 100~550배 이상 항산화력이 더 강력하다고 알려져 있다.3,4) 이러한 항산화작용은 눈 건강, 면역력 증강, 심혈관계 질환 예방 및 피부 건강에 유용하지만 아스타잔틴은 체내에서 합성되지 않는다. 따라서 눈 피로도 개선 등을 목적으로 제품 개발연구가 활발히 진행되고 있다.4~5)

갑각류에서 유기용매 또는 초임계유체를 이용해 아스타잔틴을 추출하는 방법은 추출이 용이하지만 비싼 효소 비용, 불안정한 원료공급, 추출물 중 회분과 키틴 함량이 높다는 단점이 있다. 또한, 효모에서의 아스타잔틴 추출은 생장속도는 빠르지만, 세포 당 아스타잔틴의 함유량이 적고, 생체 이용율이 낮은 3R,

3’R 형태만을 생산하여 산업적 이용이 제한적이라는 단점이 있다.6~7) 반면, 조류(藻類, algae)인 Haematococcus pluvialis는 세포 내 아스타잔틴의 함량이 1.5~3.0% 수준으로 다른 공급원에 비해 높은 함량을 나타내 불필요한 성분의 과량 제공이나 회분을 줄일 수 있고, 생체 내에서 안정한 에스터 형태의 아스타잔틴을 95% 이상 생산한다는 장점이 있다.8~9)

이에 건기공전에서는 Haematococcus pluvialis를 원재료로 한 헤마토코쿠스 추출물을 기능성 원료로 인정하고 있으며 그 기능은 ‘눈의 피로도 개선에 도움을 줄 수 있음’으로 아스타잔틴을 60 mg/g 이상 함유하도록 규정하고 있다.10)

아스타잔틴 또는 헤마토코쿠스 추출물은 국내에서 의약품 주성분으로는 허가 또는 신고된 사례가 없고 약전에도 수재되어 있지 않다. 분석법은 공정서로서 외국의 경우 미국약전(USP/NF) 및 유럽약전(EP)에 수재되어 있다.

헤마토코쿠스 추출물에서 얻어지는 아스타잔틴은 free 아스타잔틴이 5~10%, monoester 형태가 70~90%, diester 형태가 5~25%로 존재한다(Fig. 1). 따라서, 아스타잔틴 분석 시에는 먼저 monoester, diester 형태의 아스타잔틴에서 ester기를 제거하는 과정이 필요하다11). 이렇게 ester기를 제거한 free-아스타잔틴은 여러가지 구조 이성질체로 존재하며, 이 중 헤마토코쿠스 추출물에는 trans-form이 우세하나, 여러 이성질체 간의 약리학적 차이는 없다고 보고되고 있다(Fig. 2).



Fig. 1. Chemical structures of astaxanthin and its esters. A: freeastaxanthin, B: astaxanthin monoester, C: astaxanthin diester



Fig. 2. Astaxanthin geometric cis-isomer (A) and configurational isomers (B-D).

건기공전에서는 아스타잔틴 이성질체 중 주요 형태인 trans-아스타잔틴, 9-cis-아스타잔틴, 13-cis-아스타잔틴 세 이성질체의 합으로서 함량을 정량하고 있다. 아스타잔틴 시험법으로 2가지 시험법이 수재되어 있는데 모두 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(HPLC/UV)와 흡광광도계 두가지를 사용하고 있다. 시료를 아세톤에 녹이고 cholesterol esterase를 이용하여 아스타잔틴에 붙어있는 ester기를 분리시킨 후, 제1법에서는 아세톤에 녹여 역상칼럼(YMC carotenoid)으로 분리하고, 제2법에서는 이동상에 녹여 순상칼럼(Luna silica)으로 분리한 후 최대 흡수파장인 474 nm에서 검출하여 정량하는 방법이다.12)

질량분석기를 이용하여 건강기능식품 중 아스타잔틴 정량 시험을 실시한 문헌은 없어 식품 중 색소, 조류 외피(avian integument) 중 카로티노이드 색소, 헤마토코쿠스 추출물 등 다양한 시료 중의 아스타잔틴을 질량분석기로 분석한 문헌들을 참고하였다.13~15) 건강기능식품 중 아스타잔틴 분석법 연구를 수행하였고, 그 결과 다양한 매트릭스와 다성분 복합제품 등을 고려한 특이성과 감도가 높은 질량분석법을 확립하였다.

방 법(Methods)

시약 및 시료

아스타잔틴 표준품(3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4' dione, C40H52O4, 596.84, CAS NO 19044)과 cholesterol esterase, 포름산은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 아세톤 및 아세토니트릴은 HPLC 등급으로 Merck사(Whitehouse station, USA)에서 구입하였다.

시험에 사용한 시료는 품목제조신고 및 수입신고현황을 토대로 시중에 유통되는 아스타잔틴 함유 건강기능식품(복합성분) 14품목을 구매하여 사용하였다. 제품 형태는 모두 연질캡슐이었다.

표준용액의 조제

아스타잔틴 표준품 5 mg을 갈색용량플라스크에 달아 아세톤으로 녹여 100 mL로 하여 표준원액으로 하였다. 이 표준원액 5 mL를 취해 아세톤으로 100 mL로 하고 적절한 농도로 희석하여 표준용액으로 하였다.

시험용액의 조제

표준용액 조제과정과 동일하게 갈색용량플라스크를 이용하여 빛을 차단하였다. 균질화한 시료를 아스타잔틴으로서 약 1.5 mg 해당량을 달아 아세톤으로 녹여 100 mL로 하였다. 이 액 5 mL를 취해 아세톤으로 25 mL로 하고, 이 중 3 mL를 취하여 cholesterol esterase 용액 3 mL을 넣고 37°C 수욕 상에서 45분 동안 계속 교반하면서 효소 반응시켰다. 무수황산나트륨 1 g과 석유에테르 4 mL을 첨가하여 추출·탈수된 석유에테르층을 질소가스를 이용하여 완전히 건조 시킨 후 아세톤 3 mL을 넣어 용해시키고 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 하였다.

분석장비

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)는 Waters사(Milford, MA, USA)의 Acuity UPLC System이 결합된 QUATTRO MiCRO tandem 사중극자 질량분석기(Xevo TQ-D MS Detector)를, 분석용 칼럼은 Acquity UPLC® BEH C8 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm, Waters)을 사용하였다.

질량분석법 조건

건기공전 및 미국약전과 문헌들을 참고하여 전처리 조건을 검토하였다. 시험용액 조제 과정의 용매 선정을 위해 핵산·클로로포름(98·2) 혼합용매와 아세톤 두 가지 용매로 예비 실험하였다.

표준품과 시료를 전처리하는 방법은 상기 표준용액의 조제, 시험용액의 조제 란에 기재하였으며, 이 용액을 가지고 LC-MS/MS로 분석하는 조건을 확립하였다. 이때, 아스타잔틴의 cis, trans 형 이성질체를 분리하고, 특히, cis-9, cis-13을 안정적으로 분리하는 것이 분석시 핵심이었고 이를 위해 다양한 조건에서 검토하였다.

칼럼의 경우 문헌 검토를 통하여 C18 및 C8 칼럼 두 종류를 선정하고 비교해 보았다.

이동상 선정을 위해 세 가지 조건을 비교 검토하였다. 1) 0.1% 포름산이 함유된 증류수와 아세토니트릴을 gradient 조건으로, 2) 아세토니트릴·메탄올(7·3) 혼합용액과 증류수를 gradient 조건으로 3) 아세톤과 증류수를 gradient 조건으로 검토하였다.

질량분석법 이온화 방식은 APCI positive mode와 ESI positive mode 두 가지가 주로 보고되고 있으며 본 연구에서는 범용적으로 많이 사용되고 보다 접근성이 용이한 ESI mode를 선정하여 분석법을 확립하고 사용하였다.

질량분석법 유효성 확인(Validation)

직선성은 시험용액에서 아스타잔틴이 검출되는 농도범위를 중간 값으로 설정하여 총 6개의 농도 37.5, 75, 150, 300, 600, 1,200, 2,400 ng/mL에 대하여 검토하였다. 검량선의 기울기(S)와 y절편의 표준편차(σ)에 3.3배를 곱한 값(3.3×σ/S)을 검출한계로, 10배를 곱한 것(10×σ/S)을 정량한계로 설정하였다.

정확도(회수율) 평가에서 아스타잔틴을 함유하지 않는 비타민 함유 건강기능식품을 선정하여 실시하였다. 아스타잔틴 표준품을 검량선 범위 내 서로 다른 3개의 농도(1.50, 3.00, 3.70 μg/mL)가 되도록 첨가한 후 5회 반복 측정하여 회수율을 구하였다.

실험실 내 정밀도와 실험실 간 정밀도 평가에는 건강기능식품으로 판매되는 아스타잔틴 제품 중 함량 및 부형제를 고려하여 시료(시료 1 g 당 아스타잔틴 8.0 mg 함유)를 선정하여 사용하였다. 시료 100, 200, 300 mg, 3가지 양에서 각각 5회 반복 측정하여 평균과 상대표준편차(RSD)를 계산하여 분석법의 정밀도를 평가하였다. 또한, 실험실 간 검증은 3개 기관(경인청, 부산청 및 평가원)에서 실시하였다.

질량분석법의 제품 적용성 검토

유통되는 다양한 조성의 아스타잔틴 제품을 구입하여 확립된 시험법이 유통 중인 제품 시험에 적용 가능한지를 검토하였다. 이들 시료에 대하여 먼저 현재 공전 수재된 아스타잔틴 시험법(제2법)으로 함량이 적합한지를 확인하고, 본 연구에서 확립한 새로운 질량분석법에 대한 적용성 검토를 수행하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

질량분석법 최적화

다양한 조건에서 검토하여 아스타잔틴의 cis, trans형 이성질체를 분리하고, 특히, cis-9, cis-13을 안정적으로 분리하는 조건을 확립하였다.

시험용액 조제 과정의 용매 선정을 위해 핵산·클로로포름(98·2) 혼합용매와 아세톤 두 가지 용매에 대하여 예비검토한 결과 아세톤에 용해한 것이 분석에 적합하였다.

이동상 선정을 위해 세 가지 조건을 비교 실험한 결과 0.1% 포름산이 함유된 증류수와 아세토니트릴의 gradient 조건에서 감도가 좋고 이성질체 분리가 잘되며 베이스라인도 안정적이었다. 칼럼의 경우 C18 및 C8 칼럼 두 종류를 선정하고 비교한 결과 C18 칼럼의 경우는 이성질체 분리가 어려웠고 C8 칼럼에서 trans와 cis형 이성질체가 효과적으로 분리되었다. 분석 시간은 18분 조건에서는 9-cis와 13-cis 이성질체 분리가 어려웠고, 28분으로 조절했을 때 이 두 이성질체의 분리가 잘 되는 것을 확인하였다(Fig. 3).



Fig. 3. MRM chromatograms of astaxanthin by C18 column (A), C8 column for 18 minutes (B) and C8 column for 28 minutes (C).

본 실험에서 monitoring ion은 아스타잔틴 분자량 596에 수소 이온이 첨가된 m/z 597 이온을 확인하였고, m/z 597 이온에 대한 딸 이온 스캔 결과, m/z 147, 173 이온 등이 안정적으로 생성되는 것이 확인되었고, 감도가 높은 순서로 두 이온을 선택하였다. 이 중 감도가 가장 크면서 안정한 m/z 147 이온을 정량이온으로, m/z 173 이온을 정성이온으로 선정하였다.

이상 질량분석기로 아스타잔틴 분석을 위한 조건을 Table 1과 같이 확립하였다.

Analytical conditions for LC-MS/MS in the analytical method of astaxanthin

Items Conditions
Mobile Phase A: 0.1% Formic acid, B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile
*Gradient from 95:5 at initial time, 0:100 at 20~25 min, to 95:5 at 28 min, total running time 28 min.
Column Acquity UPLC® BEH C8 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)
Flow rate 0.4 mL/min
Ion mode ESI, positive
Injection vol. 2 μL
Monitor ions (m/z) 597 (precursor ion), 173, 147 (product ion)


질량분석법 유효성 확인(Validation)

특이성을 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액의 분리도 및 머무름시간 등을 확인하였다. 표준용액과 시험용액의 크로마토그램에서 모두 trans, cis-9, cis-13 피크를 확인하였다. 스캔한 결과 동일한 머무름 시간에서 선택이온의 상대적 비율이 일치하였으며, m/z 597에서 m/z 173, 147 이온이 확인되었다(Fig. 4).



Fig. 4. Representative MRM chromatogram of astaxanthin standard (A), sample (B) and MS/MS spectrum of astaxanthin (C).

직선성은 7개의 농도, 37.5~2,400 ng/mL에서 검토한 결과 상관계수(R2)는 0.999 이상이었다. 검량선(y=7.1431x+73.8179)을 이용하여 계산한 검출한계와 정량한계는 각각 16, 49 ng/mL이었다.

정확도는 시료에 표준물질을 첨가하여 회수율을 측정했을 때 91.9~97.4%로 양호한 결과이었다(Table 2). 정밀도는 시료량 100, 200, 300 mg에서 측정하였고 이 때 상대표준편차는 1.2~3.5%이었다(Table 3). 정확도, 정밀도는 AOAC 가이드라인에서16) 제시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 회수율 범위 75~120%, 상대표준편차 8%)에 모두 적합하였고 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다. 실험실간 정밀도 평가에서 3개 실험실 각각 7.88, 7.87, 7.87 mg/g, 상대표준편차는 1.8%로 AOAC 가이드라인 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 상대표준편차 16%)에 만족할 만한 결과를 나타내었으며 분석법의 일관성을 확인할 수 있었다.

Validation results (accuracy) of analytical method for the determination of astaxanthin (n=5)

Spiked Conc. (μg/mL) Measured Mean (μg/mL) (%RSD) Recovery (%)
1.50 1.38 (3.6) 91.9
3.00 2.92 (2.5) 97.4
3.70 3.46 (3.6) 93.7


Validation results (repeatability) of analytical method for the determination of astaxanthin (n=5)

Sample (mg) Astaxanthin±SD (mg/g) %RSD
100 7.55±0.21 2.8
200 7.88±0.09 1.2
300 8.41±0.29 3.5


질량분석법 적용성 검토

확립된 질량분석법을 이용하여 유통되는 아스타잔틴 제품 14건에 대하여 함량 시험을 실시하였다. 본 연구를 통해 확립된 아스타잔틴 분석법에 대한 적용성을 확인하였다. 그 결과 함량은 표시량에 대하여 84.5~114.4%로 모두 기준에 적합하였고 이들 시료에 대하여 현재 공전 시험법(LC/UV)으로 시험한 결과도 81.6~119.8%로 모두 적합하였다(Table 4).

The contents of astaxanthin in dietary supplements by LC/UV and LC-MS/MS (n=3)

No Other compounds Labeled Content (mg/g) LC/UV LC-MS/MS
Contents (mg/g) Contents (%) Contents (mg/g) Contents (%)
1 Vit E, cholesterol 17.3 20.06 115.9 19.36 111.8
2 Vit E 23.8 24.59 103.5 26.48 111.5
3 Lutein, Vit E, D 8.0 6.98 87.3 8.63 107.9
4 EPA/DHA 5.8 6.88 119.2 5.21 90.3
5 Lutein, EPA/DHA 6.0 7.19 119.8 6.86 114.4
6 Vit E 6.0 4.90 81.6 6.70 84.5
7 Lutein, Vit E 8.0 9.01 112.6 6.65 90.2
8 Vit E 7.5 7.42 98.9 6.46 86.1
9 Lutein, Vit E 8.0 7.89 98.6 8.15 101.8
10 Lutein, EPA/DHA 3.6 4.18 110.6 3.82 105.1
11 Lutein,Vit A, E, D 8.0 8.78 109.8 6.99 87.4
12 Vit E 11.8 13.68 116.2 10.07 85.6
13 Lutein, Vit A, E, D 8.0 7.81 97.6 7.75 96.9
14 Lutein, EPA/DHA, Vit A, E 2.2 2.36 106.3 2.39 107.5


현재 공전 수재 아스타잔틴 시험법(제1법, 제2법)은 시료를 추출하고 cholesterol esterase를 이용하여 ester기를 분리시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)와 액체크로마토그래프/자외부흡광광도검출기(HPLC/UV), 두 가지 기기를 이용하여 분석하는 방법이다. 흡광광도계로 474 nm에서 흡광도를 측정하여 표준용액의 농도를 산출하고 액체크로마토그래프로 시험용액 중 아스타잔틴의 이성질체(trans, 9-cis, 13-cis)별 면적을 구한 후 흡광도 검량선에 대입하여 총 아스타잔틴 함량을 계산한다. 이때 이성질체 별 전환계수를 계산식에 반영하도록 되어 있다. 이는 아스타잔틴의 흡광 특성이 이성질체마다 다르고 용매에도 영향을 받기 때문으로 분석 후 정량 과정이 복잡하고 시간이 많이 소요된다는 단점이 있다.

이에 비해 본 연구에서 확립한 LC-MS/MS를 이용한 시험법은 흡광도를 따로 측정할 필요가 없이 하나의 기기 분석으로 간편하게 실험이 가능하고 이성질체 별 전환계수가 필요없다는 장점이 있다. 다만 상대적으로 고가의 장비가 필요하고 시료를 적정한 농도로 희석하는 과정에서 주의가 필요한 것으로 사료되었다.

본 연구에서 확립된 시험법으로 유통제품 14건에 대해 분석한 결과, 표시 함량 대비 84.5~114.4%로 기준인 80~120%에 적합하고 시험분석과정이 간편하고 용이하였다. 이상 건강기능식품 중 아스타잔틴의 질량분석법(LC-MS/MS)은 현행 공전 시험 과정을 간소화하여 분석시간을 단축하여 분석효율을 증대시켰고, 기존 시험법 대비 높은 감도의 시험법임을 확인하였다.

결 론(Conclusion)

건강기능식품 중 아스타잔틴 질량분석법(LC-MS/MS)을 개발하고 확립하였다. 시험법 검증으로 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성, 실험실간 재현성을 실시하였고 모두 기준에 적합하였으며 특이성과 감도가 높았다.

본 연구에서 확립된 분석법으로 유통제품 14건에 대해 시험한 결과 전체 시료에서 분석이 용이하였다. 분석한 결과값이 표시기준에 적합하였고 이는 현재 공전시험법(제2법)과 유사하였다. 또한 기존 시험법에 비하여 감도가 매우 높아 아스타잔틴이소량 함유된 경우에도 분석이 가능하여 건강기능식품 이외의 다양한 제품 개발에 응용될 수 있을 것으로 나타났다.

특이성·감도 및 효율성이 개선되어 향후 공전시험법으로 활용 가능하며 건강기능식품뿐만 아니라 식품, 화장품 분야에서 새로운 제형, 다양한 융복합제품을 개발하는데 기여할 것으로 기대된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2018년도 식품의약품안전처의 연구개발비(18161미식안055)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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October 2022, 66 (5)
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