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Screening of Amphetamines in Human Urine by Solid-Phase Extraction Coupled with UHPLC-QOrbitrap Mass Spectrometry
Yakhak Hoeji 2021;65(6):476-480
Published online December 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Jundong Yu* and Hye-Ran Yoon**,#

*Racing Laboratory, Korea Racing Authority
**College of Pharmacy, Duksung Women’s University
Correspondence to: Hye-Ran Yoon, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Samyangro-144 gil 33, Dobong-gu, Seoul 01369, South Korea
Tel: +82-2-901-8387, Fax: +82-2-901-8386
E-mail: hyeran11@duksung.ac.kr
Received December 8, 2021; Revised December 23, 2021; Accepted December 27, 2021.
Abstract
We developed and validated a simple, sensitive, and reproducible analytical method using ultra high-pressure liquid chromatography (UHPLC)-QOrbitrap mass spectrometry to screen human urine samples for amphetamines. Amphetamines are classified under the group of abused drugs and are frequently used by jockeys. A rapid analysis method is necessary to ascertain the presence of minimal amounts of prohibited amphetamines in the urine samples of jockeys on a race day. For the method described herein, UHPLC conditions were set with a Luna Omega® C18 column using a gradient mobile phase. Six amphetamines were separated by gradient elution and detected by QOrbitrap MS in the positive ion mode. Validation parameters, including selectivity and limit of detection, were evaluated for the purpose of screening for amphetamines in human urine. Human urine samples were prepared for analysis using enzymatic hydrolysis and solidphase extraction. The limit of detection for screening the six amphetamines was between 0.1-10 ng/mL. We obtained recoveries between 31% and 76%, which is suitable for screening the amphetamines. This method combines the advantages of SPE and UHPLC-QOrbitrap MS, such as an effective extraction and simple analysis steps, and validated the amphetamine screening method for drug abuse control of jockies and improving public health.
Keywords : Screening, Amphetamines, UHPLC-QOrbitrap MS, Urine
서 론(Introduction)

“모든 스포츠의 제왕”으로 불리우는 경마는 전세계적으로 인기있는 경기로서 스포츠 베팅과 결합되어 한국에서도 연간 8조원에 가까운 매출을 올리고 있는 스포츠이기 때문에 승부의 공정성, 기수와 말의 안전을 위해 금지된 물질들에 대한 검사 또한 시행되고 있다.1) 또한 최근들어 경주 중 발생하는 안전사고에 대한 예방의 중요성이 강조되고 있고, 이에 각 국의 경마시행체들은 기수에 대해서 오남용 약물검사를 도입하였고, 한국에서도 2017년부터 경주마에 기승하는 기수들에게 마약류와 이뇨제에 대한 약물검사를 시행해 오고 있다.

이 중 암페타민류는 세계적으로 널리 오남용되는 약물로서 한국에서도 불법적으로 유통되는 사례들이 많기 때문에 가장 우선적으로 검사가 고려될 필요가 있다2). 암페타민류 검사는 소변,3) 혈액,4) 모발5) 등의 시료를 이용하고 있으나 경주 당일의 약물투여 여부를 확인하기 위해서는 소변이 채취의 용이성, 약물농도, 시료의 양 등에서 시료로서 장점이 많다.

소변 시료 중 암페타민의 분석은 유도체화를 통한 GC/MS 분석법5-7)과 LC-MS/MS8,9)를 이용한 검사법들이 보고가 되어 있다. 미량의 암페타민류 성분을 간섭물질이 많은 소변 시료에서 검출하기 위해서는 TOF10-14)나 Orbitrap15,16)과 같은 고분해능 질량분석기를 활용하는 것이 뛰어난 감도와 검출능력을 보여준다. 암페타민류는 처방없이 사용되는 것이 불법이기 때문에 정량검사보다는 정성검사를 통한 투여 여부를 밝히는 검사가 주로 행해진다. 따라서 본 시험방법은 기수의 오남용 약물검사를 주목적으로 사람의 소변 중 금지약물 성분의 함유 여부 판단을 위해 짧은 시간에 최대한 다수의 성분에 대한 정성분석을 목적으로 하여 이 중 사용 가능성이 높은 암페타민류의 암페타민 6종인, amphetamine, benzphetamine, enfluramine, methamphetamine, methylphenidate, phentermine에 대해 우선적으로 적용될 수 있도록 목표하고, 향후 다른 약물류과 동시분석법으로서의 확장성을 고려하여 스크리닝 검사법을 개발하였다.

방 법(Methods)

시약 및 기기

암페타민류 표준물질들과 내부표준물질 phenacetin은 US Pharmacopeia (Rockville, MD, USA), British Pharmacopoeia(BP) (London, UK), Sigma (St.Louis, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 용매 및 이동상인 메탄올 J.T. Baker (NJ, USA), β-Glucuronidase/arylsulfatase은 roche (Mannheim, Germany)로부터 HPLC급으로 구입하여 사용하였다. 고체상 추출용 카트리지 Bond Elut NEXUS (60 mg, 3 mL)는 Agilent (Santa Clara, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 소변 시료 분석에 사용된 초고성능 액체크로마토그래피(ultra high-pressure liquid chromatography, 이하 UHPLC)는 Dionex Ultimate 3000 system (Sunnyvale, CA, USA)와 함께 Phenomenex사의 Luna Omega (1.6 μm×2.1 mm×100 mm) 분석용 칼럼을 사용하였으며, ESI-MS/MS로는 Thermo(Bremene, Germany)사의 Q Q ExactiveTM 모델을 사용하였다.

소변 중 암페타민류 스크리닝

표준용액, 내부표준용액 및 시료 제조: 표준물질들은 메탄올에 녹여 농도를 1 mg/mL로 stock solution을 조제하여 실험 전까지 냉장 보관하였다. 이 6종 암페타민류 표준용액들을 합하여 각각의 약물농도가 2 μg/mL이 되도록 혼합용액을 조제하여 working solution으로 사용하였다.소변 2 mL에 working solution 해당량을 첨가하여 소변 중 농도가 각각 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 ng/mL이 되도록 조제하였다. 내부표준용액 조제는 phenacetine을 메탄올에 녹여 농도를 1 mg/mL이 되도록 stock solution을 조제하여 실험 전까지 냉장 보관하였다.

시료 전처리: 소변 시료 2mL를 15mL 시험관에 분주하고 1M acetate buffer (pH 5.5) 1 mL와 β-glucuronidase/arylsulfatase 50μL를 첨가하였다. 그 다음, 진탕한 후 배양기에서 55°C의 온도조건으로 2시간 동안 배양하여 가수분해 하였다. 가수분해된 소변 시료가 담긴 시험관들에 내부표준용액(Phenacetin, 2 μg/mL)을 20 μL씩 가하고, pH를 7로 맞춘 후 고체상 추출용 카트리지에 부었다. 고체상 카트리지에 정제수 3 mL를 흘려보내 세척한 후 진공펌프를 3분간 작동하여 카트리지를 건조시켰다. 최종적으로 메탄올 3 mL를 흘려서 용리시켜 시험관에 수집한 후, 이 용리액은 70oC에서 질소관류하에서 용매를 제거시켰다. 시험관에 남은 잔사에 5 mM 포름산암모늄과 0.1% 개미산이 함유된 아세토니트릴 95%을 50 μL씩 가하고 충분히 진탕한 다음 분석을 위해 바이알에 옮겨 담았다.

UHPLC-QOrbitrap 분석조건: 위와 같이 전처리 된 소변 시료의 암페타민류 스크리닝 분석은 다음 조건에서 분석되었다. UHPLC의 이동상 A는 5 mM 포름산암모늄(pH 3.0) 수용액을 사용했고, 이동상 B는 0.1% 개미산이 포함된 아세토니트릴을 사용하여 5% 농도로부터 95% 농도까지의 농도 구배조건을 사용하였다. 칼럼은 Luna Omega® C18 (1.6 μm×2.1 mm×100 mm,Phenomenex, CA, USA)을 사용하였으며, 칼럼 온도는 50°C로 하였고 유속은 0.3 mL/min로 흘려주었다.

QOrbitrap의 ESI 조건은 sheath gas flow rate 50, aux gas flow rate 10, sweep gas flow rate 1, spray voltage 4 kV, sapillary temp 320oC, aux gas heater temp 350°C으로 설정하였고 충돌 가스로는 초고순도 질소를 사용하였다. MS Acquisition은 scan range 100~700 m/z에서 Full-ddMS2 mode로 분석을 하였다. MS resolution은 full mass scan시 35,000, 각 암페타민류들의 분자식을 이용한 ddMS2 MS/MS 분석시는 17,500으로 설정하였다(Table 1).

Molecular formula, exact mass and pseudo-molecular ion [MH]+ in positive mode

Compounds Molecular formula Exact mass Ion monitored [MH]+(m/z) Expected retention time (min)
amphetamine C9H13N 135.10480 136.11208 4.65
benzphetamine C17H21N 239.16740 240.17468 8.49
fenfluramine C12H16NF3 231.12347 232.13076 8.16
methamphetamine C10H15N 149.12046 150.12773 5.07
methylphenidate C14H19NO2 233.14159 234.14886 6.74
phentermine C10H15N 149.12046 150.12773 5.44


밸리데이션: United Nations Office on Drugs and Crime(UNODC) 밸리데이션 지침서17)와 EURACHEM guide18)를 참고하여 산출인자 및 산출방법을 선정 하였으며 스크리닝 방법의 선택성(selectivity), 최저검출농도(screening detecction limit; SDL)에 대한 유효성을 평가하였다. 해당물질이 검출되었는지의 여부는 다음과 같이 확인하였다. 표준물질을 분석하여 얻은 ‘머무름 시간(RT)’과 시료 중 ‘해당물질들의 머무름 시간(RT)’ 차이가 서로 ±0.15 min 이내, 각 약물분자이온들의 ‘exact mass' 정보와 측정된 mass 값의 차이(mass error)가 5 mDa 이내인 경우 검출된 것으로 기준을 설정하였다.

분석의 정밀도를 검증하기위해 각 암페타민류의 크로마토그램상 피크의 머무름 시간과 면적의 상대표준편차(relative standard deviation, 이하 RSD (%)를 구하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

선택성(Selectivity): 본 분석법의 선택성을 판단하기 위해 약물이 추가되지 않은 공시료에서 양성으로 잘못 보고하는 위양성(false positive)의 발생여부를 확인하였다. Fig. 1은 암페타민류가 포함된 시료에서 유사분자이온(quasi-molecular ion)들의 exact mass와 피크의 머무름시간을 비교하였을 때 공시료와는 확실하게 구분이 잘 됨을 보여주고 있다. 공시료는 각기 다른 사람의 소변 시료 10개를 분석하였다. 내부표준물질(internal standard, ISTD)만을 첨가한 공시료를 분석한 결과 6종 암페타민류에 대해서 위양성의 보고가 1건도 없어 암페타민류 분석에서 본 연구의 분석법이 선택성이 있음을 확인하였다.



Fig. 1. Extracted ion chromatograms of zero sample (upper) and spiked sample (down). (A) amphetamine (B) benzphetamine (C) fenfluramine (D) methamphetamine (E) methyphenidate (F) phentermine at 3 ng/mL in urine

정밀성(Precision): 3 ng/mL의 시료들(n=10)에서 각 암페타민류의 분석한 결과 크로마토그램상에서의 피크 머무름 시간은 RSD(%) 0.06~0.25%이었고, 피크 면적들은 RSD (%) 4.6~9.2%로 양호한 반복성(repeatability)을 보여주었다.

추출효율(Recovery): 전처리 단계를 간소화하기위해 컨디셔닝 단계가 필요없는 비극성 폴리머 타입의 고체상추출 카트리지인 Bond Elut NEXUS를 이용한 간단한 추출을 수행하였다. 이를 통해 각 암페타민류들은 41~76%의 추출효율을 보였고 목표한

감도를 달성하는데 적합한 수준으로 판단되었다.

최저 검출 농도(SDL, Screening Detection Limit): 암페타민류의 각 분자 이온들([MH]+, ion monitored)은 예측된 값에서 ±5 mDa 이내에 들어야 하고 각 분자 이온들의 isotope pattern이 추가로 검토되었다. 여기에 이 이온들의 크로마토그램상 피크의 머무름 시간이 ±0.15 min 이내 든 경우 검출되었다고 판정하였으며, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 ng/mL의 다섯가지 농도에서 각각 10개씩의 시료를 분석한 결과, 10회 모두 검출되는 농도중 가장 낮은 농도를, 최저검출농도(SDL)로 하였다(Table 2).

Precision data (RSD%), screening detection limits (SDLs), and extraction recovery of amphetamines

Compound standard (3 ng/mL) spikes to urine (%) (n=10) SDL, ng/mL Extraction Recovery, (%)
Retention time (mean±SD, %RSD) Peak area (mean±SD, %RSD)
amphetamine 4.634±0.011 (0.23%) 5.73e6±4.53e5(7.9%) 3 31
benzphetamine 8.503±0.008 (0.10%) 2.44e7±2.24e6(9.2%) 1 46
fenfluramine 8.163±0.005 (0.06%) 4.83e7±2.82e6(5.8%) 0.3 76
methamphetamine 5.064±0.010 (0.19%) 3.44e7±1.94e6(5.6%) 0.3 42
methylphenidate 6.732±0.009 (0.14%) 9.96e7±5.21e6(5.2%) 0.3 75
phentermine 5.435±0.014 (0.25%) 7.65e6±3.44e5(4.5%) 3 48


고분해능 질량분석기를 사용시 Triple Quadruple MS을 사용하는것에 비하여 QOrbitrap MS는 분해능이 더 뛰어나므로 위양성을 선택성과 감도에서 훨씬 뛰어난 성능을 보여주며19) 특히 저분자량 물질 위주의 스크리닝에는 QOrbitrap을 사용시 QTOF에 비해서 검출되는 이온값들의 안정성, 분해능, 운용편의성 측면에서 유용한 측면이 있다.20) Full mass scan시 inclusion list에 작성된 조건에 맞는 목표분자 검출될 경우 자동으로 MS/MS scan(Parallel reaction monitoring, PRM)을 수행하는 ddMS2 모드 분석과 PRM spectrum을 사용하여 Library와 비교하고 매칭의 신뢰성을 높여주는 Compound database 기능을 사용할 경우 스크리닝의 정확도를 더 높일 수 있었다.

실제시료에 대한 적용: 본 검사법이 유효화 된 후 실제 시료에 적용시 대상약물의 존재 유무를 스크리닝 단계에서 정확하고 신속한 판별을 하였으며, 스크리닝 단계에서 대상약물이 존재한다고 보고가 된 경우에는 표준물질 용액, QC 시료(해당약물 spliked), 시료, 비교시료(zero sample) 네 개를 비교하는 방식으로 확인 검사를 실시하여 양·음성 판정을 하였다(Fig. 2). 1차적인 스크리닝 검사에서 양성으로 보고된 시료에 대해 2차 확인검사를 시행할 경우에는 표준시료, QC 시료의 RT와 스펙트럼을 시료의 것들과 비교분석을 하게되고 또한 위양성을 방지하기 위하여 확인검사 대상약물이 포함되어 있지 않은 비교 시료와도 비교하여 정상(일반)적인 시료에는 없는 약물 피크가 나타난 것인지 여부(selectivity)를 추가로 명확히 확인하였다.



Fig. 2. Confirmative analysis of phentermine suspicious samples after screening. (A) extracted ion chromatograms (B) parallel reaction monitoring spectra of phentermine std (1 μg/mL), QC (10 ng/mL of phentermine spiked in urine), suspicious sample, zero sample (blank urine)

Fig. 2는 스크리닝 검사에서 phentermine의 보고된 시료에 대한 확인검사시 PRM 분석의 Extracted chromatogram과 spectrum을 사용한 예를 보여주고 있다. Phentermine의 quasi-molecularion ([MH]+) m/z 151.1을 선택하여 50~170 amu 구간에서 PRM spectrum을 얻은 후 Fig. 2A는 그 중 base peak인 m/z 91.0545만을 추출하여 extraction ion chromatogram으로 표시하였다. 위에서부터 차례로 표준시료, QC시료 그리고 시료에서 phentermine의 peak가 일치된 RT에서 명확히 검출이 되고 이때 비교시료에서는 peak가 전혀 나오지 않음을 볼 수 있다.

Fig. 2B에서는 PRM 스펙트럼을 보여주는데 표준시료, QC시료 및 시료의 PRM MS/MS 스펙트럼은 일치하고 있고, 비교시료에서는 phentermine에서 나타나는 PRM 스펙트럼이 나타나지 않음을 볼 수 있다. 고분해능 Orbirap mass spectrometer를 이용할 경우 확인검사 시에도 간섭물질의 노이즈가 제거된 데이터를 얻어서, 높은 감도와 선택성을 가지고 신뢰성이 높은 수준으로 양성과 음성 여부를 판정할 수 있었다.

결 론(Conclusion)

본 연구는 간단한 고체상추출법과 함께 UHPLC-QOrbitrap MS로 스크리닝 분석을 했을 때 액체-액체 추출법을 사용하는 것에 비하여 시료 전처리 과정에서 인력과 시간을 절감하면서도 간섭물질의 영향이 없이 소변 중 암페타민류 성분 6종이 고감도로 안정적으로 검출되었고 실제 검사에 유효하게 적용될 수 있음을 시사하였다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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