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Analysis and Clinical Application of Polyunsaturated Fatty Acids in Human Serum Using One-step Extraction and Ultra-High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
Yakhak Hoeji 2021;65(6):466-475
Published online December 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Hyejin Lee and Hye-Ran Yoon#

College of Pharmacy, Duksung Women’s University
Correspondence to: Hye-Ran Yoon, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Samyangro-144 gil 33, Dobong-gu, Seoul 01369, South Korea
Tel: +82-2-901-8387, Fax: +82-2-901-8386
E-mail: hyeran11@duksung.ac.kr
Received December 6, 2021; Revised December 17, 2021; Accepted December 22, 2021.
Abstract
Omega-3 and omega-6 fatty acids are reported to alleviate various inflammatory reactions such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory bowel disease. We have developed a new method for their quantitation in serum, utilizing ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry (UHPLC-ESI-MS/MS) in multiple reaction monitoring (MRM) mode, under negative ionization. MRM transitions were detected for five omega fatty acids, as follows: α-linolenic acid, m/z=277.20→277.20; eicosapentaenoic acid, m/z=301.10→257.30; docosahexaenoic acid, m/z=327.00→283.15; arachidonic acid, m/z=303.20→259.25; docosapentaenoic acid, m/z=329.10→285.25. After comparing several different solvents, we selected butanol:methanol (1:1, v/v) as the optimal extraction solvent. Chromatographic separations were carried out using an Acclaim RSLC 120 C18 column (150×2.1 mm, 2.2 μm) at 40°C. For the mobile phase, solvent A consisted of water containing 5% acetonitrile and 5% methanol, and solvent B consisted of methyl tert-butyl ether:acetonitrile:methanol (10:20:70, v/v/v) containing 2.5 mM ammonium acetate. The calibration curve showed excellent linearity within the range of 0.01-20 μg/mL (R2=0.9996-0.9999). The analytical method was validated and shown to have excellent sensitivity (LOD; 0.001-0.005 μg/mL, LOQ; 0.01-0.2 μg/mL), making it suitable for targeted analyses of omega fatty acids. Recovery ranged from 78.0 to 103.9% (RSD 0.5-5.6%). This new method uses relatively small amounts of serum and extraction solvent and is expected to be suitable for analysis of various clinical specimens, such as plasma, urine, and cerebrospinal fluid.
Keywords : Omega fatty acid, One-step extraction, Negative ionization, UHPLC-MS/MS
서 론(Introduction)

오메가-6 지방산에 의해 야기되는 염증 대사 물질은 오메가-3 지방산이 증가하면 감소되는 것이라는 연구가 상당히 보고되고 있으므로, 천식, 염증만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류머티스성 관절염 그리고 염증성 장 질환(IBD) 같은 염증에 오메가-3 지방산은 긍정적인 영향을 미친다.1,2)

오메가-6 지방산은 가공식품, 마가린에 많이 포함되어있는 반면, 오메가-3 지방산은 주로 등푸른 생선, 과일, 견과류, 녹색 식물 등에 다량 존재한다.3,4) 본 연구에서는 지방산의 한 계열인 오메가-6 지방산인 arachidonic acid (AA), 오메가-3 지방산인 α-linolenic acid (ALA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), docosapentaenoic acid (DPA)를 표적 분석물질로 사용하였다(Fig. 1).



Fig. 1. Molecular structure for omega-3, 6 fatty acids.

오메가-3 지방산은 지질 전달자(lipid mediators)의 방출작용과 사이토카인(cytokine)의 생산 등 여러가지 염증성 질환에 항염작용을 한다.1) 이와 같은 오메가-3의 항염 작용은 아라키돈산(AA)을 전구체로 하는 염증성 물질; 아이코사노이드(프로스타글란딘, 트롬복산, 류코트리엔 그리고 리폭신)을 감소시킨다.4,5) 천식일 경우 아라키돈산에서 주로 프로스타글란딘과 cysteinyl leukotrienes (CysLTs)이 생성되기 때문에, 오메가-3는 천식의 예방과 치료에 긍정적인 영향을 미친다.6)

오메가-3, 오메가-6 지방산은 필수 지방산으로 식품을 통해서 섭취된다. 하지만 서구화된 현대 식단에 따른 과일과 채소 섭취의 감소와, 육류와 많은 가공 식품 섭취의 증가는 섭취되는 오메가-6의 비율을 증가 시키며 이는 천식을 포함한 여러 질병을 유발하는 원인이 될 수 있는 것으로 보고되었다.7) 이 보고에 따르면, 오메가-6:오메가-3 지방산의 비율을 낮게 유지하는 것이 다양한 만성 질병을 예방할 수 있다고 한다.7,8) 천식환자의 식이변화를 통하여, 오메가-3에 대한 오메가-6의 비율을 감소시켰을 때 메타콜린에 의한 호흡곤란이 개선되었다고 보고하였다.7,9) 또한 천식과 알러지 등 염증 반응이 EPA와 DHA 등의 오메가-3가 다량 함유된 식품을 섭취 했을 때, 완화되었다는 긍정적인 결과도 보고되었다.10,11)

혈청 중의 오메가-3, 6 지방산을 측정하기 위해서 가스 크로마토그래피(GC),12) 액체 크로마토그래피(HPLC),13) 핵자기 공명(NMR)14) 기기 등이 사용되어 왔다. 생체 시료 내 오메가-3, 6지방산을 검출할 때 2000년도 이전에 일반적으로 많이 사용하는것으로 보고된 기기는 GC이다. 하지만, GC는 trimethylaminoethyl(TMAE)나 trimethylsilyl (TMS) 유도체화 같은 복잡한 전 처리 과정이 필요하며 이는 많은 시간과 노동력을 필요로 한다. HPLC는 전처리 과정의 복잡성 외에도 장시간의 시료 전처리에 따른 불편함이 존재하였으며 이에 더하여 복잡한 유도체화 방법 등을 사용할 때도 있으므로 여전히 효율적인 면을 보여주지는 않았다. 2000년대 이후 HPLC 방법에 MS가 결합된 하이브리드 개념이 도입되었다. 이온화 방법도 좀 더 극성인 물질의 검출에 GC보다 유리한 이온화법인 진보된 전자분무 이온화(electrosprayionization, ESI)를 사용하게 되었다. 점차적으로 LC-ESI-MS/MS 분석 및 다중이온모니터링(multiple reaction monitoring, MRM)15,16)모드를 이용한 지방산의 분석법이 보고되기 시작하였다. 하지만 보고된 방법들도 과정이 복잡한 화학적 유도체화를15) 이용하거나 SPE와 같은 전처리 과정에서 용매 및 노동력, 시간의 소모가 많다는 단점이 여전히 존재하였다.16) 오메가-3, 6 지방산을 추출할 때는 주로 MTBE, methanol 또는 CHCl3 등의 혼합용매를 사용하는 것이 보고되었다.17)

지방산의 분리에 사용되는 컬럼으로는 Ascentis® Express C8 컬럼이나 Ascentis Express RP Amide 컬럼이 보고되었다.18,19)

본 연구는 오메가-3, 오메가-6 지방산 5종의 단순한 원스텝 용매추출법 개발과 음이온화를 이용한 UHPLC-MS/MS 분석법을 개발함으로써 일반적인 시료전처리법인 유도체화나 SPE같이 시간과 노동력이 많이 드는 단점을 보완하면서 쉽고 간편하며 빠른 전처리가 가능하게 하고자 하였다.

방 법(Methods)

시약 및 기기

30% 소 혈청 알부민(30% bovine serum albumin, BSA)은 Sigma-Aldrich사(MA, USA)에서 구입하였으며 2% BSA로 희석시켜 surrogate matrix로 사용하였다. 오메가-3, 6 지방산의 표준품 alpha-linolenic acid (ALA)은 CSN Pharm사(IL, USA)로부터 공급받았으며, docosapentaenoic acid (DPA), docosa-hexaenoic acid (DHA), arachidonic acid (AA)은 Ambeed사(IL, USA)로부터 구입하였다. Eicosapentaenoic acid (EPA)은 Tronto research chemicals사(North York, Canada)로부터 공급받아 사용하였다. 내부표준품 d8-arachidonic acid (d5-AA)은 Tronto research chemicals (North York, Canada)사로부터, d5-EPA, d5-ALA, d5-DPA와 d5-DHA은 Cayman (AA, USA)사에서 구입하였다. 표준품과 내부표준품 모두 HPLC등급으로 구입하였다(Fig. 1).

전처리 과정에서의 추출 용매 및 이동상으로 사용된 메탄올(MeOH), 3차 증류수(DDW)는 HPLC등급이며 덕산화학(Seoul, Korea)사에서 구입하였다. 아세토니트릴(ACN), 암모늄 아세트산, 아이소프로판올(IPA) 그리고 메틸삼차부틸에테르(methyl tert-butyl ether, MTBE), 클로로포름(CHCl3)은 대정화학(Siheung, Korea)사에서 구입하였다.

전처리 마지막 단계에 제단백 및 여과에 사용된 centrifuge tube filter는 Corning (NY, USA)로부터 공급받았다. Vortex는 Ohaus사(NJ., USA)로부터 구입하여 시료 전처리에 사용하였다. 탠덤질량분석기의 분무기체(nebulizer gas), 건조가스(dring gas), 충돌가스(collision gas)에 사용된 초고순도 압축 액체 질소(liquid nitrogen, 99.999%)는 유진가스사(Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.

Ultra-high-performance liquid chromatography

분석 기기로는 Shimadzu사의 Nexera X2 LC-30AD 모델의 초고성능 액체크로마토그래피 UHPLC와 함께 SIL-30AC autosampler를 사용하였다. 칼럼은 Acclaim RSLC120 C18 (150*2.1 mm, 2.2 μm) (Kyoto, Japan)을 사용하였으며, 온도는 40oC로 유지하였고, 칼럼 유속은 0.32 mL/min이었다. 시료 주입 부피는 1 μL로 설정하였다.

이동상 A는 5% ACN와 5% MeOH을 사용했고, 이동상 B는 2.5 mM 암모늄 아세트산을 포함한 30% ACN와 70% MeOH을 사용하였다. 농도 구배는 다음과 같은 조건으로 진행되었다. 이동상 A 40% 및 이동상 B 60%의 비율로 시작하여 1.5분 동안 유지하고 이동상 B가 87%의 비율로 될 때까지 6분간 변화시켰다. 이동상 B 87%의 비율을 1.5분 동안 유지 후 이동상 B 100%의 비율로 17.5분까지 변화시킨 후 10.5분을 유지하였다. 1.5분 동안 초기 비율인 이동상 A 40% 및 이동상 B 60%로 복귀하여 2분 동안 평형이 될 때까지 유지하였다.

UHPLC-ESI-MS/MS 최적 분석조건

이온화 방법으로는 ESI을 사용하였으며, Shimadzu사(Kyoto, JAPAN)의 MS/MS 8040 triple quadrupole 모델을 사용하였다. ESI-MS/MS의 조건은 다음과 같다.

이온화 모드는 negative ionization mode를 사용하였다. 스캔모드에서 어미 이온(parent ion)으로부터의 딸 이온(daughter ion)정보를 최적 이온화 시스템을 통해 얻었으며, MRM (multiple reacation monitoring) 모드에서 정량하였다. 얻어진 모든 데이터와 피크 면적을 이용한 계산은 Lab-solution software v5.93(Shimadzu, Japan)을 이용하여 분석하였다.

오메가 지방산의 분석을 위한 최적의 MS/MS 기기 조건은 interface voltage; 4.5 kV, nebulizer gas (N2) flow; 3 L/min, drying gas flow; 15 L/min, dissolution line temperature; 250oC, heatblock temperature (N2); 400oC, collision-induced dissociation gas (argon gas); 230 Kpa, detector voltage; −2.04 kV이었다. 각 분석물질의 exact mass와 머무름시간, 선택이온의 MRM transition, Q1 Q3 전압, collision energy (CE)는 Table 1에 나타내었다.

Optimazation parameter for omega fatty acids

Analytes Exact mass Retention MRM Q1 Pre Q3 Pre CE
time (min) Transition Bias (V) Bias (V)
Eicosapentaenoic acid 302.2 11.998 301.10 / 257.30 13 17 11
α-linolenic acid 278.2 12.233 277.20 / 277.20 18 17 12
Docosahexaenoic acid 328.2 12.724 327.00 / 283.15 14 29 10
Arachidonic acid 304.2 13.25 303.20 / 259.25 20 26 11
Docosapentaenoic acid 330.2 13.487 329.10 / 285.25 15 20 12


혈청 검체

이 연구는 18명의 건강한 사람 혈청과 19명의 천식 환자 혈청이 별도의 임상 시료 적용을 위하여 준비되었다. 모든 혈청 시료는 한양대학교 의과대학(Hanyang University Hospital, Seoul, Korea)에서 IRB 승인(IRB # 2012)을 받은 후 제공받았다. 혈청 시료는 분석 전까지 −20°C에서 보관하였고 분석 직전 해동하여 사용하였다.

표준용액 제조

오메가 지방산의 Stock standard solution 조제는 CHCl3:MeOH (=3:1 v/v)에 녹여 1,000 μg/mL로 조제한 후 −20°C에 보관하였다. 검량선을 작성하기 위한 일련의 Working standard solution은 solution은 메탄올로 희석하여 조제하였다. 검량선의 농도범위는 EPA; 0.2~10 μg/mL, ALA; 0.01~2 μg/mL, DHA; 0.02~4 μg/mL, AA; 0.1~20 μg/mL 그리고 DPA; 0.04~8 μg/mL이 되도록 순차적으로 희석된 7가지의 다른 농도를 조제 하여 실험에 사용하였다.

오메가 지방산의 내부표준 용액의 Stock standard solution 조제는 CHCl3:MeOH (=3:1 v/v)에 녹여 1,000 μg/mL로 조제한 후 −20°C에 보관하였다. Working internal standard 용액은 stock internal standard solution을 메탄올로 희석하여 사용하였다.

검량선 작성

검량선 작성을 위해 30% BSA를 물로 희석하여 2% BSA를 만들어 surrogate matrix로 사용하였다.

Eppendorf 튜브에, 내부표준품 혼합용액 10 μL, 2% BSA 10μL, 표준품 혼합 용액 20 μL을 첨가하였다. 이 혼합용액에 추출용매인 BuOH:MeOH (1:1, v/v) 60 μL를 샘플에 첨가하여 최종 부피 100 μL가 되도록 하였다. 위 혼합물을 10분 동안 vortexing한 뒤 Corning (NY, USA)사의 원심 분리 필터 튜브로 전체 혼합액을 옮겨 6,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 여과시켰다. 여과액을 autosampler용 유리 바이알에 옮긴 후, 그 중 1 μL를 UHPLC-ESI-MS/MS로 주입하여 분석하였다.

각 농도를 3회 반복 분석하여 검량선을 그렸으며 검량선의 결정계수(Table 2)는 최소자승법에 의하여 x축은 분석물질의 농도를, y축은 각각의 개별 분석물의 피크 면적을 내부 표준물의 피크 면적의 비로 나눈 값으로 계산하였다.

Linearity parameter for omega-3, 6 fatty acids spiked to 2% BSA

Analytes Quantification range (μg/mL) Equation R2 LOD (μg/mL) LOQ (μg/mL)
Eicosapentaenoic acid 0.2~10 Y=0.6102X+0.0895 0.9999 0.005 0.2
α-linolenic acid 0.01~2 Y=0.6223X+0.1183 0.9999 0.001 0.01
Docosahexaenoic acid 0.02~4 Y=0.2545X+0.0099 0.9996 0.002 0.02
Arachidonic acid 0.1~20 Y=2.727X-0.0190 0.9996 0.002 0.1
Docosapentaenoic acid 0.04~8 Y=0.2206X-0.1273 0.9999 0.002 0.04


밸리데이션

본 연구의 밸리데이션은 US FDA (Food & Drug Administration, US FDA) 밸리데이션 지침서를 따라서 수행하였다. S/N비가 3이 되는 농도에서 검출한계를 결정하였고, S/N비가 10이 되는 농도에서 정량한계를 결정하였다.

정확도와 정밀도는 두가지 농도의 QC sample을 5회 반복 측정을 통해 얻었다. EPA; 0.4, 8 μg/mL, ALA; 0.02, 0.4 μg/mL, DHA; 0.04, 0.8 μg/mL, AA; 0.2, 4 μg/mL 그리고 DPA; 0.8, 1.6 μg/mL에서 [검출된 농도]/[주입한 농도]×100 (%)을 이용하여 계산하였다. 정밀도 (precision)는 상대표준편차 (relative standard deviation, RSD %)로서 표현하였으며 15%를 초과하지 않아야 한다. 회수율을 구하기 위해 시료 전처리 없이 standard spiked BSA 용액으로부터 측정하여 얻은 면적비(STD area/IS area)를 이용하여 측정된 농도의 평균값에서 공시료로부터 측정되어 얻은 면적비(STD area/IS area)를 이용하여 측정된 농도값을 뺀 차이값에 대해 시료전처리를 한 후 standard spiked BSA 용액으로부터 측정하여 얻은 면적비(STD area/IS area)로 계산된 농도의 평균값을 나누어 백분율로 계산하였다.

사람 혈청시료 분석

시료 전처리는 단백질 침전 및 여과를 한 단계로 동시에 수행하였다. Eppendorf tube 내 혈청 시료 20 μL, 내부표준물질 10 μL을 첨가하였다. 이후, 추출 용매 butanol:methanol (1:1, v/v) 70 μL를 가한 뒤 10분 동안 voltexing하였다. 전체 용액을 Centrifuge tube filter (Corning사, NY, USA)로 이동시킨 후, 6,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 이 여과액을 autosampler용 유리 바이알에 옮긴 후 UHPLC-ESI-MS/MS로 1 μL를 주입하여 분석하였다. 최소자승법을 이용하여 작성된 검량선으로부터 혈청 시료 중 오메가-3, 오메가-6 지방산을 정량하였다.

자료의 통계처리

시료분석 후 얻은 data의 통계처리는 Lab-solution software v5.93 (Shimadzu, Japan)을 이용하여 분석하였다.

결 과(Results)

본 연구에서는 5종의 오메가-3, 오메가-6 지방산 분리를 위한 시료 전처리법의 최적화를 위하여 다음과 같은 방법으로 최적화하였다. 1) 여러 혼합 추출 용매를 비교 검토하여 최적의 단순한 원스텝 추출용매를 선정하였으며, 2) 다양한 컬럼을 비교 검토하여 최적 컬럼을 선정하였고, 3) UHPLC-MS/MS 및 음이온화법을 이용한 역상 액체 크로마토그래피 시스템의 최적 분석조건과 MRM 조건을 확립하였다(Table 1, Fig. 2).



Fig. 2. ESI-MS/MS spectra of omega-3, 6 fatty acids obtained on scan mode. The spectrum identifies as A; EPA, B; ALA, C; DHA, D; AA, and E; DPA

최적 분석조건 확립과 밸리데이션

오메가-3, 오메가-6 지방산을 추출할 때는 주로 MTBE, MeOH 또는 CHCl3 등의 혼합용매를 사용하는 것이 보고되었다.17) 본 연구에서는 시료 전처리법의 최적화를 위하여 다양한 혼합용매를 비교 검토하여 최적용매를 선정하였다. 총 5가지 (MTBE:MeOH=1:1, BuOH:MeOH=1:1, BuOH:MeOH:MTBE=1:1:1, BuOH:MeOH:CHCl3=1:1:1, BuOH:MeOH:ACN=1:1:1)의 추출용매에 대한 회수율 비교실험을 통해 가장 추출 효율이 높은 용매를 최종 추출 용매로 선정하였다.

각각의 용매에 대한 회수율과 편차는 다음과 같다. MTBE:ACN (4:1, v/v)는 49.2%~154.0% (RSD, 0.0~4.2%), BuOH:MeOH (1:1, v/v)은 77.8%~103.9% (RSD, 0.6~5.1%), BuOH:MeOH:MTBE (1:1:1, v/v/v)은 43.2%~116.2% (RSD, 9.2~22.8%), BuOH:MeOH:CHCl3 (1:1:1, v/v/v)은 67.9%~221.8% (RSD, 3.0~55.6%), BuOH:MeOH:ACN (1:1:1, v/v/v)은 35.3%~109.9%(RSD, 1.6~22.0%). 결과적으로 BuOH:MeOH (1:1, v/v)은 오메가-6 지방산 중 하나인 DPA에서 77.8% (RSD, 0.9%)의 회수율을 보여주었지만 DPA를 제외한 모든 물질에 대해서는 90.7%~103.9% (RSD, 0.6~5.1%)의 우수한 회수율 결과를 보여주었다. DPA은 1.7%의 높은 정밀성을 보여주었으며, 혈청 내 DPA의 농도를 고려하였을 때 77.8%의 회수율은 적합한 수준으로 판단되었기 때문에, 최종 추출용매를 butanol:MeOH (1:1, v/v)로 선정하였다.

지방산의 분리를 위해 Ascentis® Express C8, 10 cm×2.1 mm×2.7 μm (Sigma-Aldrich) 컬럼이나 50mm×2.1mm×2.7 μm Ascentis Express RP Amide 컬럼이 사용되는 것으로 보고되었다.18,19) 본 연구에서는 3가지의 컬럼을 비교 분석하여 감도를 비교하였으며 최적의 분석 컬럼으로 Acclaim RSLC120 C18을 선정하였다. 따라서 본 연구는 극성이 강한 작용기를 포함한 지질계열을 고가의 hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) 또는 metal free 컬럼이 아닌 널리 사용되는 C18 컬럼을 사용하여 분리하였다(Fig. 3).



Fig. 3. ESI-MS/MS TIC chromatogram of omega-3, 6 fatty acids. The peak identifies as a; EPA, b; ALA, c; DHA, d;AA, and e; DPA

이와 같은 추출용매와 컬럼 조건을 사용하였을 때, Fig. 3의 크로마토그램 상에서 피크가 대칭이면서 꼬리끌기가 없고 감도 또한 우수했음을 확인할 수 있다. 오메가 지방산에 대한 MRM이온과 최적 MS/MS 조건을 적용하였을 때 각각의 분석물질의 크로마토그램에 아무 간섭물질이 검출되지 않았음을 확인할 수 있다(Fig. 4). 선택성과 특이성은 공시료, 표준용액을 첨가한 시료의 크로마토그램을 서로 비교하여 방해물질 없이 잘 분리됨을 기준으로 하여 평가하였다(Fig. 5).



Fig. 4. UHPLC-MS/MS chromatograms of omega fatty acids in MRM mode. The peak identifies as a; EPA, b; ALA, c; DHA, d; AA, and e; DPA



Fig. 5. TIC of omega-3, 6 fatty acids standards on different matrix; (A) blank, (B) internal standards spiked to blank, (C) standard spiked to 2% BSA, (D) human healthy subject serum, (E) human serum with asthma. The peak identifies as a; ALA, b; EPA, c; DHA, d; AA, e; DPA, a′; ALA-d5, b′; EPA-d5, c′; DHA-d5, d′; AA-d8, and e′; DPA-d5

최적 조건의 추출용매, 컬럼 및 적합한 이동상을 선정하여 분석조건을 확립하였다. 그 후 표준품은 다음의 농도 범위에서 직선성을 보임을 확인하였다. 분석 대상 물질의 농도 범위가 EPA; 0.2-10 μg/mL, ALA; 0.01-2 μg/mL, DHA; 0.02-4 μg/mL, AA; 0.1-20 μg/mL, DPA; 0.04-8 μg/mL 일 때 직선성이 유지됨을 확인하였다. 검량선의 직선성에 대한 결정계수(R2)는 EPA (R2=0.9999), ALA (R2=0.9999), DHA (R2=0.9996), AA (R2=0.9996) 그리고 DPA (R2=0.9999)으로 모두 뛰어난 직선성을 보여주었다(Table 2).

검출한계는 0.001-0.005 μg/mL, 정량한계는 0.01-0.2 μg/mL으로 우수한 감도를 나타내었으며 사람 혈청 농도를 정량하는데 적합한 수준임을 확인하였다(Table 2). 정확도와 정밀도는 5종의 오메가 지방산에 각각 2가지 다른 농도의 표준품을 2% BSA에 첨가하여 계상하였다(n=5). 일내 분석(intra-day assay) 결과, 정확도는 95.4-103.1%이며, 정밀도는 1.6-7.6% 이내로 모두 매우 우수한 정확도와 정밀도의 결과를 보였다(Table 3).

The intra day accuracy and precision

Spiked concentrationa Measured concentrationa (mean±SD) Accuracy and precision (mean±RSD, %)
Eicosapentaenoic acid 0.4 0.38±1.5 95.4±1.6
8.0 8.0±1.4 99.2±7.6
α-linolenic acid 0.02 0.02±1.8 99.5±1.9
0.4 0.4±2.1 100.4±0.8
Docosahexaenoic acid 0.04 0.04±3.7 104.8±3.6
0.8 0.8±4.8 105.2±4.6
Arachidonic acid 0.2 0.2±1.8 99.1±1.8
4.0 4.0±2.7 100.6±2.7
Docosapentaenoic acid 0.8 0.8±3.4 101.6±3.3
1.6 1.7±1.7 103.1±1.7

aμg/mL (n=5)



분석물질의 표준품을 2% BSA에 첨가한 후 회수율을 계상하였다. 회수율은 77.8%-103.9% (RSD<5.1%)로 매우 양호한 결과를 보여주었다(Table 4, Fig. 5C).

Recovery of omega-3, 6 fatty acids spiked to 2% BSA

Analytes Recovery (%, n=3)
Mean±RSD
Eicosapentaenoic acid 93±1.6
α-linolenic acid 103.9±2.5
Docosahexaenoic acid 90.7±5.1
Arachidonic acid 103.9±2.4
Docosapentaenoic acid 77.8±0.9


혈청 중 오메가-3, 오메가-6 지방산의 정량

MRM 크로마토그램상 정상군의 혈청(Fig. 5D)와 천식 환자군의 혈청(Fig. 5E)에서의 크로마토그램을 비교해 보면 분석 물질인 오메가 지방산이 matrix effect 없이 우수한 감도의 크로마토그램을 나타냄을 볼 수 있었다.

본 연구에서는 정상군 18명의 혈청과 천식 환자군 19명의 혈청 오메가 지방산 농도를 정량하여, 정상군과 천식 환자군의 각 물질에 대한 농도를 비교하여 보았다.

오메가-3 중 EPA를 제외한 ALA, DHA 그리고 DPA는 각각 두 그룹 간 1.43배, 1.3배, 1.96배의 차이를 보였다. EPA의 평균 농도는 정상군에서 0.28 μg/mL, 천식 환자군에서 0.26 μg/mL으로 1.07배로 그룹 간 차이가 거의 없었다. 반면 오메가-6 중 AA의 천식환자 군 농도는 3.80 μg/mL으로 정상군의 평균 농도인 1.41 μg/mL보다 약 2.7배 높아 뚜렷한 차이를 나타내었다. 따라서 EPA, ALA, DHA 및 AA의 4종류의 물질에서 두 그룹 간에 유의미한 차이가 있음을 확인하였다.

이 결과는 추후 대규모의 임상 실험이 더 필요해 보이며, 오메가 지방산 분석은 유의미한 천식 관련 대사체로 정상인과 천식 환자를 구별할 수 있는 바이오마커로서의 유용성의 가능성이 있음을 시사한다(Table 5, Fig. 6).

Quantification of serum omega-3, 6 fatty acids in healthy subjects and asthmatic patients

Concentration (μg/mL) p-value
Controlb Asthmaa
Mean±SD Mean±SD
Eicosapentaenoic acid 0.28±0.06 0.26±0.05 <0.2
α-linolenic acid 5.02±2.40 3.51±1.90 <0.05
Docosahexaenoic acid 7.42±4.50 5.71±3.70 <0.2
Arachidonic acid 1.41±0.70 3.80±3.50 <0.05
Docosapentaenoic acid 1.65±0.80 0.84±0.50 <0.01

an=19, bn=18





Fig. 6. Serum omega-3, 6 fatty acids concentration in healthy subjects (n=18) and asthmatic patients (n=19).
고 찰(Discussion)

혈청이나 혈장 내 다양한 지질대사체를 분석하는 경우 일반적으로 액체-액체 추출법, 고체상추출법 또는 농축과 같은 전처리가 사용되었다.15-16) 본 연구에서는 one-step liquid extraction 방법을 적용하여 혈청 중 오메가-3, 오메가-6 지방산에 대한 새로운 분석법을 확립하였으며 밸리데이션하였다.

서구화된 현대 식단에 따른 과일과 채소 섭취의 감소와, 육류와 많은 가공 식품 섭취의 증가는 섭취되는 오메가-6의 비율을 증가 시키며 이는 천식을 포함한 여러 질병을 유발하는 원인이 될 수 있는 것으로 보고되었다.7) 이 보고에 따르면, 오메가-6:오메가-3 지방산의 비율을 낮게 유지하는 것이 다양한 만성 질병을 예방할 수 있다고 한다.7,8) 천식환자의 식이 변화를 통하여, 오메가-3에 대한 오메가-6의 비율을 감소시켰을 때 메타콜린에 의한 호흡곤란이 개선되었다고 보고하였다.7,9) 또한 천식과 알러지 등 염증 반응이 EPA와 DHA 등의 오메가-3가 다량 함유된 식품을 섭취 했을 때, 완화되었다는 긍정적인 결과도 보고되었다.10,11) 오메가-3, 오메가-6 지방산이 천식 환자와 정상군에 따라 서로 다른 농도 차이에 따른 천식에의 효과 차이가 있는지에 관한 연구는 서로 상반된 견해로 현재 논란이 있는 상황이다. Linette et al.10)에 따르면 염증성 물질의 감소와 천식 증상 개선에 오메가-3 지방산의 섭취의 영향이 있다고 본다. 오메가-6 지방산인 AA는 천식 환자군에서 증가되었다고 보고하였다.30) Kitz et al31)의 보고에 의하면 정상군보다 천식 환자군에서 오메가-6의 농도가 오메가-3보다 더 높았다. 반면, Stoodley6)의 연구결과에 따르면 O3I (Omega-3 Index; sum of EPA and DPA)이 천식 환자군에서 정상군 보다 높게 나왔음을 보고하였다. 또 다른 연구 결과인 Shahieda,26) Prasad32)에 따르면 오메가 지방산의 섭취는 천식의 개선에 아무런 영향을 끼치지 않는다고 보고되기도 하였다.

Calder et al.에 따르면, 오메가-3 지방산은 AA의 아이코사노이드인 프로스타글란딘, 류코트리엔의 생성, 염증성 사이토카인의 생성 등 여러 가지 염증질환에 항염 작용을 한다. 또한 EPA와 DHA을 섭취 시, 세포막의 지방산의 구성이 변할 수 있다. 즉, 염증 대사 물질을 야기하는 AA보다 항염증물질; resolvins, protectins등을 방출하는 EPA, DHA의 비율이 커지면 염증이 일부 개선됨을 보여준다. 따라서 본 연구 결과는 Calder et al.33)의 결과와 유사한 결과를 보이고 있다.

반면 오메가-6 중 AA의 천식환자군 농도는 3.80 μg/mL으로 정상군의 평균 농도인 1.41 μg/mL보다 약 2.7 배 높아 뚜렷한 차이를 나타내었다. 이는 Fussbroich et al.30)와 Bolte et al.34)의 보고 결과와 동일하였다. Fussbroich et al.30)에 따르면 천식 실험 쥐의 혈액 및 폐세포의 AA 농도가 비교적 크게 증가하였다. AA는 염증 발생시 효소 phosphatidylcholin-2-acylhydrases (PLA2)에 의해 세포막의 인지질로부터 생성된다. 이로 인해 혈중 AA 농도가 높아지게 된다. 천식 환자의 AA 수치는 오메가-6의 신진대사의 균형이 흐트러졌거나 환자들의 염증 반응에 부수적으로 생성 된 것일 수도 있다.34)

본 연구에서 사용된 시료 개수가 매우 제한적이므로 추후 본 연구를 좀 더 광범위한 생체시료에 적용하는 추가 연구가 필요해 보인다.추가 연구를 통하여 천식의 발생기전과 예방적인 진단 플랫폼까지 확장 개발 가능할 것이다.

결 론(Conclusion)

본 연구는 정상인과 천식 환자의 혈청 중 오메가-3, 오메가-6 지방산 5종의 정성 및 정량 분석을 위해, 단순한 원스텝 용매추출법을 개발하였고 이 분석법을 벨리데이션하였다. 임상 시료인 정상인과 천식 환자의 혈청 중 오메가-3, 오메가-6 지방산 분석에 유용하게 적용됨을 확인하였다. 추후 본 연구를 확대하여 광범위한 생체 시료에 적용한다면 천식의 발생과 생체 대사물과의 연관성 및 다양한 생체 대사과정을 이해하는 데 유용하게 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글(Acknowledgment)

본 연구는 덕성여자대학교 2020년도 교내연구비로 수행되었으므로 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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December 2021, 65 (6)
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