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Effects of Several Drugs for Metabolic Syndrome on Phorbol Ester- or Epidermal Growth Factor-induced Gene Expression and Production of Airway MUC5AC Mucin: Investigation of Potential Regulator for Hypersecretion of Airway Mucus using Drug Repositioning Strategy
Yakhak Hoeji 2021;65(6):424-431
Published online December 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Hyun Jae Lee* and Choong Jae Lee**,#

*Smith Liberal Arts College and Department of Addiction Science, Graduate School, Sahmyook University
**Department of Pharmacology, School of Medicine, Chungnam National University
Correspondence to: Dr. Choong Jae Lee, Department of Pharmacology, School of Medicine, Chungnam National University, 266 Munhwa-ro, Joong-gu, Daejeon 35015, Korea
Tel: +82-42-580-8255
Fax: +82-42-585-6627
E-mail: LCJ123@cnu.ac.kr
Received September 21, 2021; Revised November 15, 2021; Accepted November 23, 2021.
Abstract
We investigated whether rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride affects airway MUC5AC mucin gene transcription or protein expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) or epidermal growth factor (EGF) in NCI-H292 cells. Cells were pretreated with each agent for 30 min, then stimulated with PMA or EGF for 24 h. Of the five agents, rosiglitazone inhibited PMA-induced gene transcription and production of MUC5AC mucin in NCI-H292 cells. This result suggests that rosiglitazone, an antidiabetic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) agonist, can inhibit PMA-induced mucin expression at mRNA and protein levels, through directly acting on airway epithelial cells.
Keywords : Airway mucin, Rosiglitazone, Metformin, Thioctic acid, Simvastatin, Glimepiride
서 론(Introduction)

인체의 호흡기에 존재하는 점액(mucus)은 박리된 상피세포들, 혈청 단백질 삼출물, 타액과 거기에 함유된 수분, 단백질, 지질, 염류, 효소, 산화성 물질, 항산화성 물질, 내인성 항균물질, 세균, 핵산, 히스타민 등과 뮤신(mucin)의 혼합물로 구성되어 있다. ‘점액소’ 또는 ‘뮤신(mucin)’이란 고분자량의 점액성 당단백질(mucous glycoprotein) 로서 점액 중량의 2% 정도를 차지하고 있는데, 점액(mucus) 고유의 물리화학적 성질인 점탄성(viscoelasticity)을 나타나게 하는 주요한 생화학적 구성 요소로 알려져 있다. 점액은 기도 상피세포층을 덮고 있으며 mucociliary clearance작용을 통하여 환경성 유해 화학물질, 미세 입자, 병원성 미생물 등 인체외부에서 유입되는 유해인자들에 대해 인체를 방어함에 있어서 중요한 역할을 한다.1-4) 이와 같이, 생리적 상태에서는 뮤신이 생체를 방어하는 역할을 수행하지만 낭포성 섬유증, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary diseases, COPD) 인만성 기관지염, 기관지 확장증, 폐기종, 등의 만성 호흡기 질환에서 관찰되는 뮤신의 양과 질의 이상은 병리적 요소로 작용하여 끈끈한 점액의 과다생성 혹은 과다분비로 인한 기관 내강 폐쇄, 기류의 유입 저해 등을 통한 질환의 악화를 유발할 수 있다.1-4) 이처럼 과다 생성 및 분비된 점액은 기도로부터 원활히 제거되어야 하는데, 이를 위해 두 가지 방법이 사용될 수 있다. 첫째, 물리적 방법에 의한 점액의 제거, 즉 점액의 점도를 낮춘 뒤 물리적으로 흡인(aspiration)해 내는 방법이고, 둘째는, 점액 생성 자체를 억제할 수 있는 약물을 투여하는 방법이다. 물리적 방법(흡인)은 기도 내부의 자극을 유발하고, 반사기전에 의해 점액 분비를 오히려 자극하게 된다. 마취 하에서 그런 방법이 시도된다고 해도, 점액의 제거는 feedback mechanism을 통해 점액의 생성과 분비를 더욱더 자극하게 된다.5) 따라서, 점액에 점성을 부여하는 주 구성요소인 뮤신의 생성 자체를 조절하거나 혹은 분비를 조절하기 위한 약물학적 접근은 기도질환의 치료에 있어 중요한 전략이 될 수 있다.

이러한 제반 정보에 근거하여, 본 연구에서는 약물 재창출 전략, 즉 타 질환의 치료를 위해 임상의학에서 이미 활발히 사용중인 기존 의약품 가운데 제2의 약리작용으로서 호흡기 염증성 질환에 동반되는 기도 뮤신의 생성 및 과다분비를 조절할 가능성이 있는 후보물질을 탐색하고자 하였다. 기존 연구보고에 의하면, 로시글리타존은 thiazolidinedione계열 당뇨병 치료제로 지방세포 분화와 지질대사에 영향을 주는 전사인자인 peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ)에 agonist로 작용함으로써 체내 표적 조직에서 인슐린의 작용을 향상시키는 인슐린 감작약물(insulin sensitizer)이다.6) 메트포르민은 간에서 포도당과 지방산의 생성, 콜레스테롤의 합성을 저해하며 근육으로의 포도당 유입을 증가시키는 당뇨병 조절약물로 알려져 있다.7) 티옥트 산은 항산화 활성을 발현하여 산화적 세포 손상을 억제함으로써 당뇨병성 말초신경병증의 완화를 통해 당뇨병 조절약물로 사용될 수 있는 약물이다.8) 심바스타틴은 소위 statin계 약물로서 체내 콜레스테롤 생성에 있어 중요한 효소인 hydroxymethylglutaryl CoA (HMG CoA) 환원 효소의 활성을 저해하여 최종적으로 체내 콜레스테롤 농도를 저하시킴으로써 이상지질혈증 치료제로 사용된다.9) 글리메피리드는 sulfonylurea 계열 약물로 췌장 β-세포를 자극하여 인슐린을 분비시킴으로써 당뇨병 조절약물로 사용되고 있다.10) 이 약물들은 소위 대사증후군, 즉 심혈관질환 및 당뇨병의 위험을 높이는 체지방 증가, 혈압 상승, 혈당 상승, 혈중 지질 이상 등을 조절하는 약물이지만 현재까지 인간 기도 상피세포에서 뮤신 유전자의 발현 및 생성에 대해 어떠한 영향을 미치는 지 여부는 검증된 바가 없었다.

따라서, 본 연구에서는 로시글리타존, 메트포르민, 티옥트 산, 심바스타틴, 글리메피리드 등이 인간 기도 상피세포에서 포볼에스터인 PMA또는 상피세포 성장인자인 EGF에 의해 증가된 뮤신의 유전자 발현 및 생성에 있어서 어떠한 작용을 나타내는지를 검증함으로써, 효과적인 기도점액 과다생성(분비) 조절 신약의 개발을 위한 기초과학적 정보를 제공하고자 하였다.

방 법(Methods)

세포주 및 시약

NCI-H292 세포는 American Type Culture Collection사(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. Protease inhibitor cocktail은 Roche사(Indianapolis, IN, USA)에서, mouse anti-MUC5AC clone 45M1 및 HRP-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate은 NeoMarkers사(Freemont, CA, USA)에서, rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, glimepiride (Fig. 1), trypsin-EDTA, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), epidermal growth factor (EGF), Tween 20, bovine serum albumin (BSA), HEPES, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine peroxide solution(TMB), NP-40, EDTA, EGTA, ethidium bromide, diethylpyrocarbonate(DEPC) 등은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서, Easy-Blue RNA extraction kit는 INTRON biotechnology사(Kyunggi-do, Korea)에서, Accuprep RT premix kit는 Bioneer사(Daejeon, Korea)에서, 그리고 PCR Master Mix는 ABgene(Rochester, NY, USA)에서, penicillin-G, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), RPMI 1640은 GIBCO-BRL사(Grand Island, New York, USA)에서, 기타 제반 시약들은 일급시약 등급 이상의 것들을 구입하여 사용하였다.



Fig. 1. Chemical structure of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, and glimepiride

인간 기도상피 세포 (NCI-H292) 배양 및 각 약물의 처리

세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO2를 함유하는 37°C 배양기 내에서 HEPES (25 mM), penicillin G (100U/mL), streptomycin (100 μg/mL), FBS (10%, V/V) 등이 첨가된 RPMI 1640 배양액에서 배양하였는데, 1주에 2회 빈도로 subculture 하였고 배양액은 2일마다 1회씩 교체하여 주었다. 뮤신 생성 및 그 유전자 발현에 대한 약물의 작용을 검증하기 위하여, 뮤신 생성량 검증을 위해서는 24 well culture plate를 기준으로, well 당 2.0×104 cells/well 의 밀도로, 뮤신 유전자 발현 정도의 검증을 위해서는 6 well culture plate를 기준으로, well당 5.0×104cells/well 의 밀도로 각각 세포를 도포하고 배양하였다. 세포가 각 well의 70-80% 정도를 차지할 정도로 자라면, FBS의 농도를 0.2%로 감소시킨 배양액을 주고 24시간 동안 배양하고, serum을 첨가하지 않은 배양액(serum-free medium)으로 세포를 세척한 후 약물 1, 5, 10, 20 μM을 함유하는 배양액 200 μL (24 well plate 기준) 를 well마다 가하였다. 30분이 경과한 후 PMA (10 ng/mL) 혹은 EGF (25 ng/mL)을 세포에 투여한 후 37°C에서 추가로 24시간 동안 배양하였다. 11-13)

MUC5AC 뮤신 생성량 측정

각 약물의 처리 기간이 종료된 후, 배상세포 내 생성되어 저장되어 있는 뮤신을 정량하기 위하여, 세포 용해용 완충액(20 mM Tris, 0.5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, protease inhibitor cocktail)을 가하여 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 추출하였다. 즉시로, 효소연계 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 뮤신의 생성량을 다음과 같이 측정하였다. 뮤신을 함유하고 있는 배양상층액 및 수거된 cell lysate를 각각 PBS로 1/10배 희석하고, 희석된 각 sample을 ELISA 전용의 96-well plate에 각각 100 μL씩 분포시킨 후 42°C에서 완전히 건조시켰다. 그 후 PBS-Tween 20(0.05%, PBS-T) 용액 200 μL/well을 이용, 각 well당 3회씩 세척하였다. 세척 후 PBS-T에 용해된 2% BSA 용액 200 μL를 각 well당 가하고 다시 1시간 동안 incubation하였다. 1시간 후 PBST 200 μL로 3회 세척하고MUC5AC에 대한 monoclonal antibody인 mouse anti-MUC5AC clone 45M1을 2% BSA에 1:200의 비율로 희석한 후에, 각 well당 100 μL씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다. 1시간 후 PBS-T로 3회 세척하고 2차 항체인 Horse radish peroxidase (HRP)-Goat Anti-Mouse IgG Conjugate를 2% BSA에 1:3,000의 비율로 희석한 후, 각 well당 100 μL씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다. PBS-T로 다시 3회 세척 후 3,3',5,5'-tetramethyl-benzidine peroxide (TMB) 용액 100 μL를 각 well에 첨가하고 5분 후 1N H2SO4 50 μL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450 nm에서 각 well의 흡광도를 측정함으로써 대조군과 약물 처리군에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 정량하였다.11-13)

Total RNA의 분리

24시간 동안 각 약물을 처리한 세포를 냉각된 PBS로 2회 세척하였다. 세포에 trypsin-EDTA 용액을 처리하여 배양 용기 바닥으로부터 분리하고, 세포들의 혼합물을 1.5 mL 용량의 microtube에 옮겨 원심 분리함으로써 세포들만 수거하였다. 이어서, total RNA를 분리하고자 INTRON biotechnology사의 Easy-Blue RNA extraction kit (total RNA isolation reagent)를 이용해 (0.5 mL/4x105 cells) 세포를 lysis 시키고, 상온에서 5분간 방치하였다. 5분 후 즉시, microtube 에 chloroform을 첨가, 15초간 vortexing 하고 상온에 2-3분간 방치한 후 4°C, 13,000 rpm (Hanil centrifuge MICRO 17 R, Seoul, Korea)에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상층액 400 μL를 새 microtube에 옮겼다. 상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 잘 혼합한 후 상온에서 10분간 방치하고 다시 4°C, 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물에 diethylpyrocarbonate (DEPC) 가 함유된 75% ethanol 을 가하고 4°C, 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리함으로써 세척하였다. 수거된 RNA 침전물을 5분간 대기 중에서 건조시킨 후, 20 μL의 RNase-free water로 부유시키고, spectrophotometer(Beckman-Coulter, DU-650, Brea, CA, USA)를 사용하여 260 nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 RNA 의 농도를 측정한 후 실험에 사용하였다.14)

PCR (Polymerase Chain Reaction)을 위한 primer 제조

PCR에 사용된 primer 는 전문 제조회사인 Genotec (주)(Daejeon, Korea)에 주문, 합성하였다. NCI-H292 세포에서의human MUC5AC 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3', antisense primer의 염기서열은 5'-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGGG-3'이었다. 정량적 대조 유전자로 사용된 Rig/S15 유전자 primer의 염기서열은 (sense primer) 5'-TTC CGC AAG TTC ACC TAC C-3' 및 (antisense primer) 5'-CGG GCC GGC CAT GCT TTA CG-3'이었다.

RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

수거된 total RNA를 이용, 역전사 반응(Reverse Transcription)으로 cDNA를 만들고, 이를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다. 즉, 얻어진 total RNA 1 μg을 75°C 에서 5분간 가열함으로써 denaturation시키고, 이를 얼음에 담가 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다. MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응에서 얻은 cDNA 산물 2 μL를 PCR premix kit 의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다. 증폭반응을 위하여, PCR을 40회 실시(PCR thermal cycler, Takara MP-300, Japan)하였으며, denaturation은 94°C에서 30초, annealing은 60°C에서 30초, extension은 72°C에서 30초간 각각 시행하였다.

전기영동에 의한 중합효소 연쇄반응 산물의 확인

RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 cDNA 산물들을 전기영동으로 분리함으로써 MUC5AC 유전자 발현 변동 여부를 관찰하였다. 즉, 증폭된 PCR 산물 10 μL를 10×gel loading buffer (0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 50% glycerol)와 잘 혼합한 다음, Tris-acetate-EDTA buffer(40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA) 용액 및 1 μg/mL의 ethidium bromide가 함유된 1.0% agarose gel에서 전기 영동하였다. Gel 상에서 이동된 각각의 DNA band는 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)를 이용하여 관찰하고, 사진 촬영하였다.

통계처리

모든 측정 결과는 Mean±SEM으로 환산한 후, 약물 처리군의 측정치는 대조군 측정치의 백분율로 나타냈다. 통계처리는 oneway ANOVA 및 post-hoc test 로서 Holm-Sidak test를 이용하였으며 p<0.05인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

호흡기 질환의 임상에서 과다 생성 및 분비된 점액의 효율적

제거를 목적으로 N-acetyl L-cysteine (NAC), 2-mercaptoethane sulfonate sodium (MESNA), letocysteine, ambroxol, bromhexine, azithromycin, dornase alfa, glyceryl guaiacolate, hypertonic saline solution, myrtol, erdosteine, mannitol, sobrerol, S-carboxymethyl cysteine 등 다수의 점액용해제 및 거담제 등이 사용되고 있으나 그 작용 및 작용 기전이 불명확하며 약물 투여 및 점액의 물리적 제거에 따르는 반사적 과다분비 현상 등으로 인하여 점액 과 다분비 질환의 효율적 조절은 용이하지 않은 것으로 알려져 있다.15) 현재, 임상적으로 호흡기 점액의 과다 생성 및 분비를 효과적으로 조절하기 위하여 사용할 수 있는 유망한 약물은 당질 코 르티코이드계 약물(glucocorticoids)로 알려져 있으나 동반되는 광범위한 부작용이 치료 약물로서의 가치를 제한하고 있다.

호흡기에 존재하는 뮤신은 펩티드 골격과 탄수화물 가지로 이루어진 수백만 dalton의 분자량을 가진 당단백질(glycoprotein)로 서, 뮤신의 펩티드 골격을 coding하는 유전자를 MUC로 약칭하 는데, 현재까지 MUC 1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20 등 20여종의 MUC 유전자가 발견되었다. 이 중에서 MUC5AC와 MUC5B 유전자의 산물인 MUC5AC와 MUC5B 뮤신이 인간의 호흡기에서 발견되는 겔 형성 뮤신(gel-forming mucin)을 구성하고 있다.15) 한편, 인체 기도 뮤신의 생성 및 유전자 발현 조절과 연관된 연구모델로 자주 사용되는 인간 기도 상피세포인 NCI-H292 세포에 대해, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)는 protein kinase C (PKC), diacylglycerol (DAG)의 활성화 인자로, 유전자 전사와 세포 분화를 조절할 수 있으며MUC5AC 뮤신 유전자 발현을 유도할 수 있음도 보고되 어 있다.16-18)

또한, EGF는 EGF receptor signaling pathway를 경유하여 MUC5AC 뮤신의 유전자 발현 및 생성을 자극하며, 천식 환자 의 기도에서 EGF 수용체의 발현량이 증가되어 있음도 보고되 어 있다. 인체 내에서 EGF 수용체는 상피세포 기능의 일차적 조절자로 중요한 역할을 수행하고 있으며, 수용체 자극 인자를 통한 세포 외부신호를 세포 내 신호전달체계인 MEK-MAPK로 전달하게 된다. 활성화된 MAPK는 전사인자인 Sp1의 활성화를 유발하고 최종적으로 MUC5AC 뮤신 유전자의 발현이 증가하게 된다.19-21)

이러한 기존의 보고에 근거하여 수행된 본 연구의 결과, 로시 글리타존, 메트포르민, 티옥트산, 심바스타틴, 글리메피리드 중 로시글리타존만이 PMA처리로 증가된MUC5AC 유전자 발현을 용량의존적으로 억제하는 경향을 나타내었다(Fig. 2(A), (B), (C), (D), (E)). 또한, 상피세포 성장인자인 EGF처리로 증가된MUC5AC 유전자 발현에 대해서는 5개 약물 중 심바스타틴, 로시글리타존, 글리메피리드가 억제하는 경향을 보여주었다(Fig. 3(A), (B), (C), (D), (E)). 또한, PMA로 자극된 MUC5AC 기도 뮤신 생성 증가 현상에 미치는 영향을 검증한 결과, 로시글리타존과 글리메피리드만이 MUC5AC 기도 뮤신의 생성을 억제하였다. 각 처리 농 도 별 뮤신의 양은, 대조군, PMA 단독 처리군, 로시글리타존 10-6 M+PMA, 로시글리타존 5×10-6 M+PMA, 로시글리타존 10-5 M+PMA, 로시글리타존 2×10-5 M+PMA 처리군에서 각각 100±3, 570±10, 534±5, 476±7, 337±10, 240±3%이었고, 대조군, PMA



Fig. 2. Effect of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride on PMA-induced MUC5AC gene expression in NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride for 30 min and then stimulated with PMA (10 ng/mL) for 24 h. MUC5AC gene expression was measured by RT-PCR. As a quantitative control, primers for Rig/S15 rRNA, which encodes a small ribosomal subunit protein, a housekeeping gene that was constitutively expressed, were used. Three independent experiments were performed and the representative data were shown (A-E). (cont: control, R: rosiglitazone (A), M: metformin (B), T: thioctic acid (C), S: simvastatin (D), G: glimepiride (E), concentration unit is μM.)



Fig. 3. Effect of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride on EGF-induced MUC5AC gene expression in NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride for 30 min and then stimulated with EGF (25 ng/mL) for 24 h. MUC5AC gene expression was measured by RT-PCR. As a quantitative control, primers for Rig/S15 rRNA, which encodes a small ribosomal subunit protein, a housekeeping gene that was constitutively expressed, were used. Three independent experiments were performed and the representative data were shown (A-E). (cont: control, R: rosiglitazone (A), M: metformin (B), T: thioctic acid (C), S: simvastatin (D), G: glimepiride (E), concentration unit is μM.)

단독 처리군, 메트포르민 10-6 M+PMA, 메트포르민 5×10-6 M+PMA, 메트포르민 10-5 M+PMA, 메트포르민 2×10-5 M+PMA 처리군에서 각각 100±6, 234±1, 229±4, 228±8, 221±9, 206±4% 이었고, 대조군, PMA 단독 처리군, 티옥트 산 10-6 M+PMA, 티 옥트 산 5×10-6 M+PMA, 티옥트 산 10-5 M+PMA, 티옥트 산 2×10-5 M+PMA 처리군에서 각각 100±6, 254±8, 239±12, 237±8, 241±9, 232±6%이었고, 대조군, PMA 단독 처리군, 심바스타틴 10-6 M+PMA, 심바스타틴 5×10-6 M+PMA, 심바스타틴 10-5 M+PMA, 심바스타틴 2×10-5 M+PMA 처리군에서 각각 100±7, 315±9, 293±6, 285±8, 291±6, 282±7%이었고, 대조군, PMA 단독처리군, 글리메피리드 10-6 M+PMA, 글리메피리드 5×10-6 M+ PMA, 글리메피리드 10-5 M+PMA, 글리메피리드 2×10-5 M+PMA 처리군에서 각각 100±6, 254±5, 252±6, 247±5, 210±4, 189±3% 이었다(Fig. 4(A), (B), (C), (D), (E)).



Fig. 4. Effect of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride on PMA-induced MUC5AC mucin production from NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride for 30 min and then stimulated with PMA (10 ng/mL) for 24 h. Cell lysates were collected for measurement of MUC5AC mucin production by ELISA. Each bar represents a mean±SEM of 3 culture wells in comparison with that of control set at 100%. Three independent experiments were performed and the representative data were shown (A-E). * significantly different from control (p<0.05). + significantly different from PMA alone (p<0.05). (cont: control, R: rosiglitazone (A), M: metformin (B), T: thioctic acid (C), S: simvastatin (D), G: glimepiride (E), concentration unit is μM.)

5개 약물이 EGF로 자극된 MUC5AC 기도 뮤신 생성 증가현 상에 미치는 영향에 대한 검증 결과로, 티옥트 산만이 최고 처 리 농도에서 기도 뮤신의 생성을 억제함을 알게 되었다. 각 처 리 농도 별 뮤신의 양은, 대조군, EGF 단독 처리군, 로시글리타 존 10-6 M+EGF, 로시글리타존 5×10-6 M+EGF, 로시글리타존 10-5 M+EGF, 로시글리타존 2×10-5 M+EGF 처리군에서 각각 100±7, 248±6, 238±5, 254±5, 229±8, 241±7%이었고, 대조군, EGF 단독처리군, 메트포르민 10-6 M+EGF, 메트포르민 5×10-6 M+EGF, 메 트포르민 10-5 M+EGF, 메트포르민 2×10-5 M+EGF 처리군에서 각각 100±9, 258±8, 265±9, 249±5, 273±7, 263±6%이었고, 대조군, EGF 단독 처리군, 티옥트 산 10-6 M+EGF, 티옥트 산 5×10-6 M+EGF, 티옥트 산 10-5 M+EGF, 티옥트 산 2×10-5 M+EGF 처 리군에서 각각 100±8, 256±9, 243±6, 226±8, 214±9, 188±18% 이었고, 대조군, EGF 단독 처리군, 심바스타틴 10-6 M+EGF, 심 바스타틴 5×10-6 M+EGF, 심바스타틴10-5 M+EGF, 심바스타틴 2×10-5 M+EGF 처리군에서 각각 100±5, 226±6, 225±5, 228±3, 220±3, 205±7%이었고, 대조군, EGF 단독 처리군, 글리메피리드 10-6 M+EGF, 글리메피리드 5×10-6 M+EGF, 글리메피리드 10-5 M+EGF, 글리메피리드 2×10-5 M+EGF 처리군에서 각각 100±5, 259±6, 248±6, 251±5, 249±7, 242±8%이었다(Fig. 5(A), (B), (C), (D), (E)).



Fig. 5. Effect of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride on EGF-induced MUC5AC mucin production from NCI-H292 cells. NCI-H292 cells were pretreated with varying concentrations of rosiglitazone, metformin, thioctic acid, simvastatin, or glimepiride for 30 min and then stimulated with EGF (25 ng/mL) for 24 h. Cell lysates were collected for measurement of MUC5AC mucin production by ELISA. Each bar represents a mean±SEM of 3 culture wells in comparison with that of control set at 100%. Three independent experiments were performed and the representative data were shown (A-E). * significantly different from control (p<0.05). + significantly different from EGF alone (p<0.05). (cont: control, R: rosiglitazone (A), M: metformin (B), T: thioctic acid (C), S: simvastatin (D), G: glimepiride (E), concentration unit is μM.)

이러한 실험 결과를 종합적으로 분석해 보면, 5개 약물 중 로 시글리타존만이 PMA처리로 증가된 MUC5AC 기도 뮤신의 유 전자 발현 및 뮤신 당단백질 생성을 일관되게 억제할 가능성을 보여주었음을 알 수 있다. 로시글리타존은 인슐린 감작제로서 근육, 지방 조직, 간에서 지방의 저장량 재분포 작용 외에 항염 증 활성을 발현하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 고유의 약리 학적 작용 이외에 제2의 약리작용으로서 호흡기 뮤신의 생성 및 유전자 발현 조절 가능성을 보여준 로시글리타존의 분자 수준 에서의 작용기전은 아직 규명된 바 없다. 기존의 연구보고에 의 하면, MUC5AC 유전자의 주요 전사조절 인자로 알려진 NF-κB 는 세포질 내에서 IκB (inhibitory kappa B)와 결합되어 불활성 상태로 있지만, PMA등에 의한 자극에 의해 비활성 상태의 IKK(inhibitory kappa B kinase)가 활성화됨으로써 이어서 IκBα가 인 산화되고 분해되면, p65로 대표되는 단백질들이 세포핵 내로 이 동함으로써 MUC5AC 유전자의 전사를 활성화시키는 것으로 알 려져 있다.22,23) 따라서, 향후의 연구를 통하여 로시글리타존이 NCI-H292 세포에서PMA-유도성 NF-kB p65의 핵 내로의 이동 (translocation)에 대하여 어떠한 작용을 나타내는지, 즉 기도 상 피세포 내 NF-kB p65 단백질의 활성화 과정에 미치는 영향을 검증함으로써 분자 수준에서의 약리작용 기전을 일부 규명할 수 있을 것으로 판단된다.

결 론(Conclusion)

대사증후군 조절을 위해 사용 중인 5개 약물 중 로시글리타존은 기도 상피세포층 배상세포에서의 뮤신 유전자 발현 및 생성에 이르는 전 과정에 걸쳐 일관된 억제작용을 나타냄으로써, 유망한 뮤신 생성 및 유전자 발현 조절약물로의 개발 가능성을 보여주고 있다. 비록 제한점이 있지만 본 연구에서 얻어진 이러한 지견들은 호흡기 점액의 과다생성 및 분비를 보이는 천식, 만성 기관지염 등 다양한 호흡기 염증성 질환의 진행 과정에서기도 뮤신의 과다한 생성 및 분비 억제에 초점을 둔, 점액 조절용 신약후보물질 개발에 관한 기초과학적 정보를 제공함에 있어 일부 기여할 수 있을 것으로 판단된다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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December 2021, 65 (6)
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