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Synthesis and Evaluation of Pyridazine Analogs as Potential Antidiabetic Agents
Yakhak Hoeji 2021;65(4):331-334
Published online August 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Duy-Viet Vo and Haeil Park#

College of Pharmacy, Kangwon National University
Correspondence to: Haeil Park, College of Pharmacy, Kangwon National University, Gangwondaehakgil 1, Chuncheon 24343, Republic of Korea
Tel: +82-33-250-6920, Fax: +82-33-5369
E-mail: haeilp@kangwon.ac.kr
Received July 9, 2021; Revised August 5, 2021; Accepted August 20, 2021.
Abstract
3,6-Disubstituted pyridazine analogs (2a and 2b) were synthesized from commercially available 3,6-dichloropyridazine in two steps. The synthesized compounds were evaluated for their GPR119 agonistic activity. Both compounds exhibited much stronger EC50 values than that of oleylethanolamide (OEA) and were proved to be partial agonists. These results indicate that the pyridazine ring can be used as a potential heterocycle scaffold for GPR119 agonists.
Keywords : GPR119 agonists, Antidiabetic agents, Fragment structure, Bioequivalent, Pyridazine analogs, Lead compounds
서 론(Introduction)

당뇨병은 가장 보편적인 대사성질환의 하나로서 전 세계적으로 약 3.82억명의 환자가 고통을 받으며 이들 중 약 90%가 제2형의 당뇨병 환자로 추정된다.1) 일반적으로 제2형 당뇨병 환자는 심혈관질환, 허혈성 심장질환, 뇌졸증 및 하지절단등의 합병증으로 당뇨가 없는 일반인에 비해 평균수명이 약 10년 단축된다는 보고가 있다.2-3) 제2형 당뇨치료제로 인슐린, 멧포민, 글리타존계, 설포닐우레아계, 글루카곤 유사 펩타이드, 디펩타이드-4분해효소억제제등이 사용되고 있으나,4) 현재 사용하는 당뇨치료제는 모두 부작용을 갖는 것으로 알려져 있다. 예로서, 인슐린및 유사 약물은 저혈당 및 체중 증가가 있으며 주사제로 투여하는 불편함이 단점이다. 이와 같은 이유로 부작용이 최소한으로 경감된 경구용당뇨제에 대한 신약개발이 요구된다.5)

당단백결합수용체119 (GPR119: Glucose-protein coupled receptor 119)는 췌장의 베타세포에 빈번하게 발현되는 수용체이며 효능제로는 올레일에타놀아민, 리소포스파티딜콜린, N-올레일도파민 및 오르바닐등이 알려져 있고 이들 물질은 시험관 실험에서당 의존성 인슐린 분비를, 생체 실험에서는 체내 혈당을 저하시키는 것 뿐만 아니라 인크레틴 분비를 촉진하는 작용도 보고되었다. 따라서, GPR119 효능제는 제2형 당뇨 치료 뿐만 아니라당 항상성을 개선는 반면 포만감과 식욕을 억제하여 체중을 감소하는 효과로 비만을 조절하는 기능을 갖는 아주 좋은 항당뇨타겟으로 등장하였다.6-8)

최근, GPR119 효능제로 작용하는 강력한 경구용 당뇨치료 후보물질로 Arena화합물이 최초로 보고되었다.9) 이 발견 이후에다수의 제약회사 및 연구기관에서 GPR119 타겟에 효능제로 작용하는 제2형 당뇨치료제 연구를 수행하여 효능이 개선된 수 개의 후보물질을 도출하였다(Fig. 1).

이들의 분자구조를 고찰한 결과 개발 중인 약물구조에서 공통적으로 발견된 약리작용단으로 분류되는 치환기의 일반적인 패턴은 체내에서 양이온 형성부위에 해당하는 피페리딘 부분구조, 치환된 평면형 벤젠환 부분구조가 방향성의 헤테로환 scaffolds에 직선형에 가까운 모양으로 배열된 형태의 화합물에서 좋은약효를 나타내는 점이 공통적으로 관찰되었다. 이와 같은 다국적 제약사의 선행연구 결과를 바탕으로 다양한 방향성 헤테로환 scaffolds를 탐색하는 연구가 지난 10년에 걸쳐 활발히 진행되고 있다(Fig. 1).10-16)



Fig. 1. Structures of selected known GPR119 agonists
방 법(Methods)

본 연구실에서는 지난 수년에 걸쳐 이와 같은 다국적 제약사의 GPR119 효능제 선행연구와는 차별화하여 일반적으로 확인된 약리작용단 중 피페리딘환의 생동등체로 간주될 부분구조로서 피페리딘 환에 비해 유동성이 적고 부피가 큰 azabicyclic 치환체를 도입한 후보물질을 검토하여 효능이 크게 증강된 다수의 리간드 개발에 관한 연구결과를 발표하였다(Fig. 2).17-19) 약적성질 (drug-like properties) 증강을 목적으로 유동성이 적은 분자를 설계하면 수용체와의 결합력이 강하고 수용체 선택성이 높은 뿐 아니라 경구제로의 개발 가능성이 높은 화합물을 얻을 수있다는 보고가 있다.20)



Fig. 2. Structures of target compounds in our group

본 논문에서 지향하는 새로운 목표는 이미 잘 알려진 세 부분의 약리작용단 중에서 기존 약물개발의 타겟으로 다양한 연구가 보고된 평면형 벤젠환 부분구조의 생동등체 개발에 두었다. 이번 연구는 알려진 방향성 scaffolds와는 상이하지만 쉽게제조(구)할 수 있는 방향성 헤테로환 scaffolds를 탐색하는 연구를 수행하여 신규 GPR119 효능제 개발의 가능성을 검토하였다.쉽게 제조 가능한 후보물질의 개발은 추후 전임상/임상 연구에소요되는 약물의 제조량을 감안하면 매우 중요하게 고려할 요소하다. 방향족 헤테로환의 교체가 활성에 미치는 영향을 다국적제약사의 화합물과 비교하기 위하여 2-플루오로-4-메틸설포닐아민 및 피페리딘 부분구조는 유지하였다.

기존의 방향성 헤테로환 스캐폴드(aromatic/Ar heterocycle scaf-fold)를 대체할 생동등체 효과를 나타낼 수 있는 방향족 헤테로환으로 입체적/전자적으로 환경이 유사한 피리다진환을 선정하였다. 피리다진환은 피리미딘환과 매우 유사하지만 헤테로환의 질소원자의 배열이 피리미딘환과 다른 생동등 관능기로 판단하였다. 더욱이, 피리다진환을 이용한 신규 GPR119효능제 개발 연구는 시약으로 저가에 구매할 수 있는 3,6-디클로로피리다진을 출발물질로 사용하여 방향성 피리다진환의 3,6-위치에 약리작용단으로 간주되는 부분구조의 유동성이 감소한 한 4-피페리딘아민 혹은 4-피페리딘알콜 부분구조와 4-메틸설포닐아민 부분구조를갖는 목표화합물을 합성하고, 이와 같은 부분구조의 유동성 변화가 당단백수용체119에 대한 in vitro 효능에 미치는 영향을 평가하여 선도물질 발견 가능성을 가늠해 보는데 목적이 있다(Fig. 3).



Fig. 3. Structures of target pyridazine analogs
결과 및 고찰(Results and Discussion)

목표화합물은 시약으로 구매한(Fisher Scientific Co. Ltd.) 3,6-디클로로피리다진을 사용하여 2단계 과정을 거쳐 합성하였으며,경로와 반응조건은 Scheme 1에 상세히 표시하였다. 목표화합물의 합성에는 두번의 친핵성 방향족 치환반응을 시행하였는데 일반적으로 두번째 친핵성 치환반응은 반응조건이 어렵고 수율도매우 낮은 경향을 보였다. 또한 친핵체의 종류 (O/N)에 따라서도 반응성 및 수율의 차이점을 나타내었다.



Fig. 4. Scheme 1. Synthetic procedure, reagents and conditions of pyridazine analogs. i) NaH/THF (dry), 60°C, DMSO (for 1a); Cs2CO3, Pd(OAc)2, BINAP, N2, Toluene, sealed tube (for 1b) ii) Pd(OAc)2, CuI, PPh3, Cs2CO3, Dioxane-H2O, N2 (for 2a and 2b)

3,6-디클로로피리다진(298 mg, 2 mmole), tert-butyl 4-hydroxyp-iperidine carboxylate (402 g, 2.2 mmole)을 1mL의 DMSO에 용해 후, 2 mL의 무수 THF에 현탁시킨 69 mg의 60% NaH sus-pension in mineral oil을 가한 후, 반응액을 60°C에서14 시간 반응하였다. 조생성물을 hexane-ethyl acetate (2:1) 용매로 flash column chromatography를 수행하여 목적의 중간체 화합물 1a (백색 고체, 527 mg, 84%)를 얻었다.

한편, 아민기를 도입하는 친핵 반응은 알콜류의 친핵 반응에비해 반응성과 수율이 훨씬 저조하여 다양한 반응조건을 검토한 결과 팔라듐 촉매의 Buchwald반응조건에서 수행하였다. 3,6-디클로로피리다진(298 mg, 2 mmol), tert-butyl 4-aminopiperidine carboxylate (402 mg, 2.2 mmol), Cs2CO3 (1,300 mg, 4.0 mmol), Pd(OAc)2 (23mg, 0.1mmol), 2,2-bis(diphenylphosphino)-1,5-binaphthyl (BINAP, 187 mg, 0.3 mmol)을 110°C에서 질소 가스를 충전한sealed tube 에서 14시간 반응 후 조생성물을 hexane-ethyl acetate (2:1) 용매로 flash column chromatography를 수행하여 중간체 화합물 1b (미황색 고체, 300 mg, 48%)를 얻었다.

중간체 화합물(1a, 1b)과 4-메틸설포닐아닐린의 친핵 반응은다양한 방법을 검토를 한 결과 Buchwald 반응조건에 당량의 CuI를 첨가한 반응에서 30~55% 수율로 생성물을 얻을 수 있었다. Pd(OAc)2 (2.3 mg, 0.01 mmol)와 PPh3 (7.9 mg, 0.03 mmol)을sealed tube에 넣고 1,4-dioxane 0.25 mL과 물 0.25 mL을 가한 후80°C에서 2-3분 가열 후 중간체 화합물 1a (314 mg, 1 mmol), 4-메틸설포닐아닐린(205 mg, 1.2 mmol), Cu(1)I (190 mg, 1 mmol), Cs2CO3 (650 mg, 2 mmol)를 가한 후 질소 충전 하에서 16시간가열하였다. 반응액을 상온으로 냉각 후, 클로로포름으로 추출하고 물로 세척 후, 유기층을 분리하여 무수 황산마그네슘으로건조 후 여과하고 여액을 감압논축하여 조화합물을 얻었다. 조화합물을 flash column chromatography를 실행하여(CH2Cl2:CH3OH =30:1) 황색고체의 화합물 2a (134 mg, 30%)를 제조하였다.

중간체 1b (252 mg, 0.8 mmol)를 같은 방법으로 반응-정제하여 황색고체의 화합물 2b (193 mg, 54%)를 제조하였다.

tert-Butyl 4-((6-chloropyridazin-3-yl)oxy)piperidine-1-carboxy late (1a)

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (d, J=9.2 Hz, 1H), 6.91 (d, J=9.2 Hz, 1H), 5.49-5.33 (m, 1H), 3.84-3.69 (m, 2H), 3.37-3.16 (m, 2H), 2.11-1.98 (m, 2H), 1.78-1.68 (m, 2H), 1.45 (s, 9H); ESIMS: m/z 314 [M+H]+.

tert-Butyl 4-((6-chloropyridazin-3-yl)amino)piperidine-1-carb oxylate (1b)

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.14 (d, J=9.3 Hz, 1H), 6.67 (d, J=9.3 Hz, 1H), 4.93 (d, J=6.7 Hz, 1H), 4.14-3.92 (m, 3H), 2.91 (t, J=12.2 Hz, 2H), 2.06 (dd, J=12.4, 2.3 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.41-1.32 (m, 2H); ESIMS: m/z 313 [M+H]+.

tert-Butyl 4-((6-((4-(methylsulfonyl)phenyl)amino) pyridazin-3-yl)oxy)piperidine-1-carboxylate (2a)

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.25 (d, J=7.5 Hz, 2H), 6.89 (dd, J=20.1, 7.4 Hz, 2H), 4.83 (tt, J=7.7, 3.2 Hz, 1H), 3.78-3.73 (m, J=12.4, 5.3 Hz, 2H), 3.55-3.50 (m, 2H), 2.92 (s, 3H), 2.46-2.39 (m, 2H), 1.95-1.88 (m, 2H), 1.48 (s, 9H); ESIMS: m/z 449 [M+H]+.

tert-Butyl 4-((6-((4-(methylsulfonyl)phenyl)amino) pyridazin-3-yl)amino)piperidine-1-carboxylate (2b)

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.44 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.91 (dd, J=13.6, 9.2 Hz, 3H), 7.80-7.72 (m, 3H), 4.11 (dd, J=13.4, 4.5 Hz, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.69 (td, J=13.2, 2.7 Hz, 2H), 2.06-1.80 (m, 2H), 1.72-1.60 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.18-1.07 (m, 2H); ESIMS: m/z 448 [M+H]+.



Fig. 5. Table 1

합성된 피리다진 화합물의 활성은 당단백결합 수용체에 대한세포-기반 cAMP assay 방법에18 따라 hGPR119 수용체의 활성화 효능을 체외(in vitro)에서 평가하였다. 화합물(2a, 2b)의 활성은 EC50와 %Max 수치로 나타내었다. EC50값은 올레일에탄올 아마이드(OEA)의 최대 효능의 50%에 해당하는 cAMP를 활성화시키는 화합물의 농도이며, %Max 값은 화합물이 나타내는 활성 강도 최대값이다.

결 론(Conclusion)

합성된 피리다진 유도체 2a2b는 각각 205 nM, <10 nM정도에서 강력한 cAMP stimulation 활성을 보여 효능제로 알려진 대조물질 OEA에 비해 매우 강력한 EC50값을 보유한 사실을확인하였다. 그러나, 효능 최대치는 59.0%와 74.3%의 값을 나타내어 다소 약한 결과를 나타내었다. 비록 이와 같은 결과는 아직 기대치에는 미치지 못하지만, 저가이며 쉽게 구매하여 사용가능한 피리다진환 출발물질을 신규 헤테로환 scaffold로 이용하여 2 단계의 합성과정을 거쳐 cAMP stimulation 활성을 개선한GPR119 효능제를 발견한 점에 중요성이 있다. 이번 연구에서합성된 피리다진 화합물(2a, 2b)을 선도화합물로 이용하여, 추후연계된 다수의 피리다진계 화합물을 합성하고 이들을 이용하여구조-활성 상관관계 연구를 수행하면 임상연구에 사용할 만큼강력하고 효능이 좋은 후보물질을 탐색하는 기초연구 자료로 활용할 수 있다는 점에서 이번 연구의 가치가 있다고 사료된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 “2017년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성비(관리번호-520170393)”의 지원에 의해 수행 되었으며, 실험에 필요한 물질 구조 분석, 생리활성 검색에 사용된 기기 및 시설은 강원대학교 공동실습관 및 신약개발연구소의 도움을 받았으며 이에 감사 드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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August 2021, 65 (4)
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