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Characterization of Immune Checkpoint Inhibition Efficacy through Inhibition of Exosome Secretion by Calcium Channel Blockers in Melanoma
Yakhak Hoeji 2021;65(4):313-320
Published online August 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Md Rakibul Alam, Jong-In Kim, Chan-Hyeong Lee, Seong-Sik Park, and Moon-Chang Baek#

Department of Molecular Medicine, CMRI, Exosome Convergence Research Center (ECRC), College of Medicine, Kyungpook National University
Correspondence to: Moon-Chang Baek, Department of Molecular Medicine, CMRI, Exosome Convergence Research Center (ECRC), College of Medicine, Kyungpook National University, Gukchebosang-ro, Jung-gu, Daegu, Republic of Korea
Tel: +82-53-420-4948, Fax: +82-53-426-4944
E-mail: mcbaek@knu.ac.kr

These authors contributed equally to this work
Received June 11, 2021; Revised August 19, 2021; Accepted August 27, 2021.
Abstract
Melanoma is a belligerent cutaneous malignancy. Multiple therapeutic options, including immunotherapy and targeted therapy, have shown remarkable promise in treating metastatic melanoma. Exosomes containing programmed cell death ligand 1 (PD-L1) secreted from melanoma bind to programmed cell death 1 (PD-1) on the surface of CD8+ T cells. As a result, melanoma not only evades the immune surveillance of CD8+ T cells but also inhibits their activation and facilitates the growth and proliferation of cancer cells. In this study, we identified nicardipine, an FDA-approved L-type calcium channel inhibitor, which downregulates the expression of proteins involved in exosome biogenesis and secretion as well as exosomal PD-L1 secretion, from metastatic melanoma cells. Furthermore, nicardipine suppresses PD-L1 expression after interferon-γ-mediated stimulation and enhances CD8+ cell function, similar to the function of PD-L1-blocking antibodies in cancer therapies. This could lead to the development of next-generation anticancer drugs for the treatment of metastatic melanoma.
Keywords : Melanoma, Exosomes, PD-L1, Immunosuppression, Calcium channel blocker
서 론(Introduction)

전이성 흑색종은 표피의 기저층, 안구의 중간 포도막에 위치한 멜라닌 세포에서 발생한다. 임상적으로 흑색종은 예후가 좋지 않는 암으로 알려져있다. 그러나, 흑색종 환자의 PD-L1 (Programmed cell death Ligand 1)과 같은 면역 관문에 대해 표적 치료와 면역 요법의 발전으로 인해 극적으로 흑색종 치료에도움이 되고 있다.1) 환자들은 병용 접근법으로 치료 효과가 개선되고 있지만 분자 표적 치료는 약물 내성과 관련이 있으며 면역 관문의 차단으로 인한 독성 증가와 관련이 있다.2,3) 이러한 독성을 제한하여 치료 반응을 용이하게 하는 약제와의 차세대병용 전략은 전이성 흑색종 치료를 위한 약물 개발에 있어 최우선 순위가 될 수 있다.

종양에서 방출된 엑소좀(Exosome)은 50~150 nm 크기의 미세입자로 숙주 세포의 생물학적 물질(단백질, 지질, RNA, 및 DNA)들을 전달하여 최종적으로 종양 진행, 혈관 신생 및 면역 내성을 촉진한다.4)~6) 전이성 흑색종은 CD8+ 세포 표면에 발현된 PD-1 (Programmed cell death 1)과 결합하는 PD-L1을 포함한 엑소좀을 방출한다고 알려져 있다.7),8)

PD-1/PD-L1 결합은 CD8+ T 세포의 활성화를 억제하여 CD8+ T 세포가 매개된 암세포 사멸로부터 암세포를 보호한다.9) 또한암세포에서 PD-L1은 T 세포에서 분비되는 IFN-γ (Interferon-gamma)에 의해 자극된다고 알려져 있다.10)

그러므로, 암세포 유래 엑소좀의 분비 및 PD-L1를 억제하는약물을 개발하는 것은 면역 관문 차단에 의한 독성을 제한할 수있다.

정상적인 세포의 항상성에서 세포질 칼슘(Ca2+)의 농도는 여러 신호 과정들을 제어하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 수많은 암에서 발견되는 칼슘(Ca2+) 농도의 불균형은 증식 및 전이의 원인으로 가정된다.11) 엑소좀 분비와 세포 내 칼슘(Ca2+) 농도의 상관관계는 세포 내에서 엑소좀 생합성 과정 중 다중 소포체(Multivesicluar bodies)들이 원형질막의 융합으로 인해 엑소좀의 형태로 세포외 배출(Exocytosis) 동안 칼슘(Ca2+) 농도가 상승할수록 엑소좀 분비에 촉진하는 것으로 알려져 있다.12,13)

따라서 우리는 FDA (Food and Drug Administration)과 같은규제 기관에서 승인한 칼슘채널 차단제를 기반으로 세포 내의칼슘(Ca2+)의 농도를 낮춤과 동시에 새로운 엑소좀 분비 억제제의 개발로의 잠재적인 가능성을 규명할 수 있다고 생각했다. 니카르디핀(Nicardipine)은 L형-칼슘채널 차단제로 FDA가 승인한모든 항고혈압제 중 가장 많이 처방되는 약물 중 하나이다.14) 그러나, 니카르디핀을 포함한 시판되고 있는 암로디핀(Amlodipine),15)니페디핀(Nifedipine)16)과 같은 칼슘채널 차단제는 두통을 야기하는 일반적인 부작용이 존재한다.17) 니카르디핀은 다른 칼슘채널차단제와 비교하여 부정적인 전리 효과가 적고 타 부작용에 대해 위험이 적은 약물로 알려져 있다.18,19)

본 연구진들은 니카르디핀이 흑색종 유래의 엑소좀 생합성 및분비 조절을 통해 PD-L1 발현 조절과 연관이 있음을 세포 및동물 실험에서 규명하였으며, 엑소좀 분비 억제제로의 잠재적인가능성을 제안한다.

방 법(Methods)

세포주와 세포 배양

A375, SK-MEL-28과 같은 모든 흑색종 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구매하였다. 지침서에 따라 각 세포에 대한 권장 배양 배지와 10% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, Hyclone, USA), 1% 항생제/항진균제(Antibiotic/Antimycotic, Hyclone, USA)를 함께 용해시켜 사용하였으며, 5% CO2 및 95% O2, 37°C 조건의 세포 배양기에서 성장시켰다.

엑소좀 분리

엑소좀을 분리하기 위해 A375, SK-MEL-28 세포가 배양된 배양액을 회수하였다. 다음으로, 300×g, 3분, 2,500×g, 20분, 10,000×g, 30분으로 순차적으로 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이후에 0.2 μM 시린지 필터(Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 사용하여 상청액을 여과하였다. 여과한 상청액은 초고속원심분리기와 SW-28 로터(Beckman Coulter, USA)을 사용하여 120,000×g, 90분 동안 초고속 원심 분리하였다. 다음으로, 엑소좀 펠릿을 가용성 단백질로부터 순도를 향상시키기 위해 PBS (Hyclone, USA)에 재현탁하고 다시 120,000×g, 90분 동안 초고속 원심 분리하였다. 마지막으로 정제된 엑소좀은 다양한 세포실험에 사용하기 위해 PBS 또는 1× RIPA buffer (Merk Milipore, USA)에 재현탁시켰다.

나노 입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis)

Nano-sight LM10 기기(Nanosight, UK)를 사용하여 세포 배양상청액에서 분리한 엑소좀을 분석했다. 이 분석을 위해 405 nm의 단색 레이저빔이 적용되었으며, 30 프레임/초. 30초 길이의비디오를 촬영하고 NTA Software version 2.3 (Nanosight, UK)을사용하여 엑소좀의 움직임과 크기를 분석하였다.

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Quantitative real time PCR)

제조사의 권고에 따라 TRIzol reagent (#15596026, Invitrogen, USA)을 사용하여 서로 다른 흑색종 세포의 총 RNA를 추출하였다. 다음 RT-premix (K2041, Bioneer, Republic of Korea)를사용하여 총 2 μg RNA를 전사시켰다.

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 통한 유전자 발현 분석은 유전자 특이적 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 세 가지 생물학적 복제를 통해 완료하였다. 역전사 효소 반응은 SYBR premix (#4368577, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 ABI stepOne plus 기기(Thermo Scientific, USA)에서 수행되었다. 동일한 양의 cDNA 템플릿을 사용하여 각 샘플을 PCR 증폭하였다. qRT-PCR에 사용된 유전자 및 프라이머는 표에 정리하였다(Table 1). 유전자 간 상대적인 수준 차이는 β-actin을 기준으로하여 ΔΔCt 방법으로 계산하였다.

List of genes and primer sequences applied to Quantitative RT-PCR

Gene Forward primer Reverse primer
RAB 27A 5’- AGT TGA TGG AGC GAA CTG CT-3’ 5’- CCC TAC ACC AGA GTC TCC CA-3’
RAB 7 5’-GAT GGT GGA TGA CAGGCT AGT-3’ 5’-CGA GAGACT GGA ACC GTT CCT-3’
RAB 5A 5’-ACG GGC CAA ATA CGG GAA AT-3’ 5’- TCA AAC TTT ACC CCA ATG GTA CT-3’
β-actin 5’-TTC CTG GGC ATG GAG TCC TGT GG-3’ 5’-CGC CTA GAA GCA TTT GCG GTG G-3’


웨스턴 블롯팅(Western blotting)

전체 세포에서 수집된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 변성 분리하였고 Nitrocellulose membrane으로 이전시켰다. 이를 상온에서 5% Skim milk 용액에 2시간 동안 block한 후, 각 단백질에대한 적절한 1차 항체를 넣어 4°C에서 12~16시간 반응시킨 후HRP (Horseradish peroxidase) 형광이 결합된 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시켰다. 블롯은 ECL 검출 용액(#34580, Thermo Scientific, USA)으로 현상하였으며, AGFA 필름(AGFA, Belgium)을 사용하여 정량화했다.

본 실험에 사용한 1차 항체의 정보 및 조건은 다음과 같다.

CD63 (ab68418, 1:1000, abcam), Alix (ab56932, 1:1000, abcam), Flotillin-1 (#3253, 1:1000; Cell Signaling Technology), β-actin (#4670, 1:3000; CST), Rab27a (ab55667, 1:1000; Abcam), Rab5 (ab18211, 1:1000; Abcam), Rab7 (ab50533, 1:1000; Abcam), PD-L1 (#13684, 1:1000; CST), p-JAK2 (#4406, 1:1000; CST), JAK2 (#3230, 1:1000; CST), p-STAT1 (#9167, 1:1000; CST), STAT1 (#14994, 1:1000; CST), IRF-1 (#8478, 1:1000; CST).

인간 흑색종 세포인 A375 세포를 이종 이식한 xenograft 모델에서 human cell-specific 엑소좀을 확인하기 위한 1차 항체는anti-human CD63 (SHI-EXO-M02, 1:1000; Cosmo Bio Co., Ltd)을 사용하였다.

In vivo 실험

모든 동물 실험은 경북대학교 동물실험윤리위원회에서 승인한 지침에 따라 수행되었다. 인간 흑색종 이식 모델을 구축하기위해 A375 세포를 5×106 세포/100 μL (50 μL PBS+50 μL Matrigel)가 되게 준비하여 7주령 암컷 BALB/C 누드 마우스(Orientbio, Republic of Korea)에 주입하였다. 이 후 니카르디핀을 5, 10 mg/kg의 농도로 매일 복강 내 주입하였다. 모든 마우스들은 암세포를 접종한 지 21일차에 안락사하였다. 안락사 직후, 심장 천자를 통해 혈액을 채취하여 실험실 지침에 따라 엑소좀을 분리하였다.

통계 분석

모든 실험은 달리 명시되지 않는 한 비독립적으로 3 번의 실험을 통해 데이터 수치들을 획득하였다.

실험 결과의 데이터 수치들은 평균±표준편차(Standard deviation)로 나타내었다, 각 군 간의 비교는 unpaired “t-test”로 이루어졌다. 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 유의미한 차이를 나타내는것으로 간주하였다.

데이터 분석은 PRSIM 6 software (GraphPad Software, Inc.)를사용하여 수행했다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

칼슘 채널 차단제에 의한 엑소좀 PD-L1 억제 효과 규명

본 연구진들은 칼슘 채널 차단제가 엑소좀 분비를 억제하는지 확인하기 위해 세포 독성이 없는 농도인 10, 20 nM의 니카르디핀과 니페디핀을 A375 세포에 24시간 동안 노출시킨 후, 초고속 원심분리기를 사용하여 엑소좀을 분리하고 나노 입자 추적 분석(NTA)을 수행하였다. 그 결과, 두 가지 약물 모두 A375세포로부터 분비되는 엑소좀이 약물의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1A). 더 나아가, A375 세포의 미세소포들(Microvesicles)의 억제에도 영향을 미친다는 것을 유의미한 결과로 확인하였다(Fig. 1B). 반면에 SK-MEL-28 세포의 미세소포 억제 간 상관관계에서는 유의성 있는 결과를 확인할 수없었다. 본 연구진들은 칼슘 채널 차단제가 엑소좀 분비를 억제한다는 결과를 바탕으로 엑소좀의 PD-L1도 억제할 수 있는지확인하였다. 니카르디핀을 농도별로 처리한 동일한 개수의 A375세포로부터 엑소좀을 분리하고 웨스턴 블롯을 통해 CD63, Alix, Flotillin-1과 같은 엑소좀 마커들과 함께 PD-L1의 발현이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1C). 이러한 결과들이 in vitro 상에서 뿐만 아니라 in vivo 상에서도 동일한 결과를 관찰할 수 있는지 확인하기 위해 A375 세포를 이종이식(xenograft)한 마우스모델에 니카르디핀을 매일 5, 10 mg/kg 의 농도로 매일 복강 내 투여하고 21일 후, 마우스의 혈장에서 분리한 엑소좀의 PD-L1발현 변화를 확인하였다. 이때, 칼슘 채널 차단제가 암세포 유래 엑소좀 PD-L1의 발현 변화에 직접적으로 관여하는지 확인하기 위해 동일한 양의 엑소좀 단백질에서의 PD-L1 수준을 확인하였다. 그 결과, 칼슘 채널 차단제가 in vitro, in vivo 상에서 모두 암세포 유래 엑소좀 PD-L1 발현 억제에 기여한다는 것을 확인하였다(Fig. 1D).



Fig. 1. Calcium channel blockers inhibit secretion of exosomal PD-L1. (A) A375-derived exosome secretion by calcium channel blockers is dose-dependent inhibition compared to the vehicle group. (B) 20 nM of nicardipine inhibited microvesicles secreted from A375 cells. On the other hand, inhibition of microvesicles could not be observed in SK-MEL-28. (C) Western blotting for PD-L1 and various protein from A375 cell derived exosomes. Exosome proteins isolated from equal cell numbers (5×106) were loaded per lane. (D) Calcium channel blockers suppress circulating PD-L1 in A375 xenograft model. All lanes are loaded with equal amount of total proteins (20 μg). All experiments were performed in triple replications. Significance was determined using an unpaired two-tailed student’s t-test. ***p<0.001, **p<0.005, *p<0.05 Error bar, SD.

칼슘 채널 차단제 처리에 의한 엑소좀 분비 억제 기전 연구

엑소좀의 생합성 및 분비가 되는 기전은 세포 외부로부터 세포 내에서 Intraluminal vesicles (ILVs)가 들어있는 다중소포체(Mutivesicular bodies, MVBs)을 형성하게 된다. 이러한 형태가세포의 원형질막과 결합하여 비로소 ILVs가 엑소좀의 형태로 세포 외부로 방출하게 된다.20) 본 연구진들은 칼슘 채널 차단제 처리에 의한 엑소좀 분비 억제가 세포 내에서 엑소좀 생합성과 분비에 관여하는 mRNA, 단백질들의 변화가 있을 것이라 생각하였다. 따라서 우리는 MVBs와 ILVs의 형성에 기여하는 Rab 5, Rab 7, Alix와 엑소좀 분비에 관여하는 Rab 27a들에 대해 mRNA수준과 단백질 발현의 변화를 확인하였다. A375, SK-MEL 28세포에 10, 20 nM 농도의 니카르디핀을 처리하였을 때, RAB 27A, RAB 7, RAB 5A의 mRNA 수준이 모두 약물의 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(Fig. 2A), Rab 27a, Rab 7, Rab 5, Alix의 단백질 발현도 모두 약물의 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2B). 이 결과들로20 nM의 니카르디핀이 엑소좀 생합성 및 분비에 관여하는 mRNA수준과 단백질의 발현을 억제하는 데 가장 효과적인 농도라는것을 확인하였다. 또한, Alix는 ESCRT 기계에 의존적으로 조절하여 MVBs 형성 및 성숙에 중요하게 관여한다.21) 종합적으로,칼슘 채널 차단제는 Alix의 발현을 억제시켜 ESCRT 기계를 의존적으로 억제하고 최종적으로 엑소좀 생합성과 분비에 관여하는 유전자와 단백질을 모두 억제하여 엑소좀 PD-L1의 감소를이끌어낸다.



Fig. 2. Calcium channel blockers inhibit exosome secretion and biogenesis. (A) qRT-PCR analysis of various genes in treatment with nicardipine in A375, SK-MEL-28 cells. This experiment was performed in duplicate. Nicardipine represses at the transcriptional level for genes such as RAB 27A, RAB 7, and RAB 5A that are involved in exosome biogenesis and secretion. (B) Western blotting for the indicated in A375 (left), SK-MEL-28 (right) cells. β-actin was used as loading control for whole-cell lysates. This experiment was performed in triple replications. Protein expression involved in exosome biogenesis and secretion, such as Rab 27a, Rab 7, Rab 5, decreases in a dose-dependent manner. Significance were determined using an unpaired two-tailed student’s t-test. ***p<0.001, **p<0.005, *p<0.05 Error bar, SD.

칼슘 채널 차단제 처리에 의한 IFN-γ로 유도된 PD-L1 발현의억제

다른 연구진들은 니카르디핀과 같은 또 다른 칼슘채널 차단제인 암로디핀(Amlodipine)22)과 디하이드로피리딘(Dihydropyridine)23)이 세포의 PD-L1의 발현을 억제한다고 보고하였다. 따라서 니카르디핀도 세포의 PD-L1의 발현을 억제할 수 있는 지 확인하였다. A375, SK-MEL-28 세포에 니카르디핀을 처리하였을 때,세포의 PD-L1 발현이 억제되었고, 이에 따라 동일 단백질 양의엑소좀에서의 PD-L1 발현도 억제된다는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 다음으로, IFN-γ가 PD-L1을 유도한다는 이전 보고를 바탕으로 칼슘 채널 차단제들을 처리함으로써 IFN-γ에 의해 유도된세포의 PD-L1과 엑소좀 PD-L1의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하였다. 먼저, A375 세포에 IFN-γ를 처리하고 20 nM의니카르디핀과 니페디핀을 각각 추가로 처리하였을 때, 대조군보다 엑소좀의 분비가 감소하는 것을 NTA를 통해 확인하였다(Fig. 3B). 또한, IFN-γ에 의해 유도된 세포의 PD-L1 및 엑소좀의 PD-L1 발현도 칼슘 채널 차단제들의 처리에 의해 발현이 억제되는것을 확인하였다(Fig. 3C). 이 결과는 암세포에서의 칼슘 신호가세포 PD-L1의 발현을 조절한다는 기존의 보고와 일치한다.22)



Fig. 3. Calcium channel blockers inhibit IFN-γ-induced cellular and exosomal PD-L1. (A) Western blotting of cellular (left) and exosomal (right) PD-L1 from A375, SK-MEL-28 cells treated with 20 nM nicardipine. β-actin was used as loading control for whole-cell lysate and exosomes. (B) Relative values of exosome secretion. After A375 cells were stimulated with IFN-γ at 10 ng/mL for 48 h and then treated with the indicated concentrations and secreted calcium channel blockers. (C) The expression of cellular and exosomal PD-L1 from A375 (left), SKMEL- 28 (right) cells stimulated with IFN-γ and treated with calcium channel blockers. All lanes were loaded with same amount of proteins (20 μg). β-actin was used as loading control for whole-cell lysates and exosomes. All experiments were performed in triple replications. Significance were determined using an unpaired two-tailed student’s t-test. ***p<0.001, **p<0.005, *p<0.05 Error bar, SD.

JAK2/STAT1/IRF1 신호전달 억제를 통한 IFN-γ에 의해 자극된 PD-L1 발현의 억제 기전

본 연구진들은 칼슘채널 차단제들이 어떠한 기전을 통해 IFN-γ에 의해 자극된 PD-L1의 발현을 억제하는 것인지 조사하였다. IFN-γ는 IFN-γ 수용체와 결합을 통해 JAK2을 통한 STAT1의 인산화를 유도하고 PD-L1의 발현을 조절하는 IRF1을 유도한다고 알려져 있다.10) 따라서 칼슘채널 차단제 처리에 의한 JAK2/STAT/ 1RF1 신호전달에 관여하는 단백질들의 발현 차이를 확인하였다. A375 세포에 IFN-γ (10 ng/mL)을 처리한 후, 10, 20 nM의니카르디핀과 니페디핀을 처리하였을 때, phospho-JAK2, JAK2, phospho-STAT1, STAT1, IRF1과 같은 단백질의 발현이 감소하는것을 확인하였다(Fig. 4). 종합해보면, 칼슘채널 차단제는 JAK2/STAT1/IRF1 신호전달과 관련된 단백질의 발현을 억제함으로써PD-L1이 억제한다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 암세포의PD-L1 발현을 억제함으로써 CD8+ T 세포의 PD-1과의 결합을감소시킬 수 있고, 활성화된 CD8+ T 세포가 분비하는 사이토카인과 같은 물질들에 의해 암세포를 사멸할 수 있을 것으로 사료된다.



Fig. 4. Calcium channel blockers inhibit IFN-γ-induced PD-L1 expression through down-regulation of JAK2/STAT1/IRF1 signaling. Western blotting for phospho-JAK2, JAK2, phospho- STAT1, STAT1 and IRF1 in whole-cell lysates after stimulation with IFN-γ (10 ng/mL) for 48 h and treatment with calcium channel blockers. All lanes were loaded with same amount of whole-cell lysates (20 μg). This experiment was performed in triple replications.
결론(Conclusion)

본 연구에서 항고혈압제로 사용되고 있는 FDA 승인 약물인니카르디핀을 포함하여 다른 칼슘채널 차단제가 엑소좀의 생합성과 분비에 관여하는 유전자 및 단백질의 발현을 억제하여 엑소좀의 분비 억제를 통한 PD-L1의 발현이 억제되는 것을 in vtiroin vivo 상에서 규명하였다(Fig. 5). 또한, 암세포에서 IFN-γ와 IFN-γ 수용체 간의 결합에 의해 활성화된 JAK2/STAT1/IRF1신호전달이 PD-L1의 발현을 증가시키고, 이 때, 칼슘 채널 차단제들의 처리는 IFN-γ에 의해 유도된 JAK2/STAT1/IRF1 신호전달을 억제함으로써 PD-L1을 다시 억제시키는 것을 확인하였다.이는 기존 항고혈압제로 사용되고 있는 칼슘채널 차단제가 엑소좀 분비 및 PD-L1 발현을 억제하여 항종양 면역을 강화할 수있는 새로운 억제제로의 잠재적인 개발 가능성을 보여준다.



Fig. 5. Proposed model for inhibition of exosome secretion and IFN-γ-induced PD-L1 by calcium channel blockers. Calcium channel blockers inhibit the exosome biogenesis and secretion from cancer cells by blocking calcium channels. In addition, The expression of IFN-γ stimulation-mediated PD-L1 can be suppressed by calcium channel blockers inhibiting the JAK2/STAT1/IRF1 signaling pathway.
감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2018학년도 경북대학교 국립대학육성사업 지원비에 의하여 연구되었으며, 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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August 2021, 65 (4)
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