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Simultaneous Analyses of 5 Omega Fatty Acids on Dried Serum Spot using Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
Yakhak Hoeji 2021;65(4):264-275
Published online August 31, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Hyejin Lee and Hye-Ran Yoon#

College of Pharmacy, Duksung Women’s University
Correspondence to: Hye-Ran Yoon, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Samyangro-144 gil 33, Dobong-gu, Seoul 01369, South Korea
Tel: +82-2-901-8387, Fax: +82-2-901-8386
E-mail: hyeran11@duksung.ac.kr
Received May 25, 2021; Revised July 8, 2021; Accepted July 28, 2021.
Abstract
Omega fatty acids play an important role as biomarkers of chronic inflammatory diseases such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory bowel disease. The purpose of our study was to develop a new analytical method for the detection of omega fatty acids from dried serum spots. We developed an ultra-high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry (UHPLC-ESI-MS/MS)-based method in the multiple reaction monitoring (MRM) mode with negative ionization. The detected MRM transitions for five omega fatty acids are as follow: α-linolenic acid (m/z=277.20→277.20), eicosapentaenoic acid (m/z=301.10→257.30), docosahexaenoic acid (m/z=327.00→283.15), arachidonic acid (m/z=303.20→259.25), and docosapentaenoic acid (m/z= 329.10→285.25). The calibration curve showed an excellent linearity within 0.1-2.5 μg/mL range (R2=0.9947~0.9994). The analytical methods howed excellent sensitivity (LOD: 0.005-0.01 μg/mL, LOQ: 0.03-0.1 μg/mL), which would allow for the targeted analyses of omega fatty acids. The recoveries of the omega fatty acid from the dried serum spots were 92.6%-110.4% (RSD: ±0.2%-9.6%) and the retention time was within 5 min. This improved method offers rapid and sensitive quantification of omega fatty acids on dried serum spots using a small volume of serum and is expected to be applied to various biological specimens.
Keywords : Omega fatty acid, Dried serum spot, Negative ionization, UPLC-MS/MS, Asthma
서 론(Introduction)

오메가-3 지방산은 오메가-6 지방산이 방출하는 염증 대사 물질을 낮추는 역할을 함으로써, 천식, 염증만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류머티스성 관절염 그리고 염증성 장 질환(IBD) 같은염증에 긍정적인 영향을 미친다.1,2)

오메가-3 지방산은 주로 등푸른 생선, 과일, 견과류, 녹색 식물 등, 오메가-6 지방산은 가공식품, 마가린에 많이 포함되어있다.3,4) 본 연구에서 표적으로 한 대표적인 분석물질 오메가-3지방산에는 α-linolenic acid (ALA), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), docosapentaenoic acid (DPA) 과오메가-6 지방산 arachidonic acid (AA)이 있다(Fig. 1). 오메가-3 지방산은 사이토카인(cytokine)의 생산 및 지질 전달자(lipid medi-ators)의 방출작용 등 여러가지 염증질환에 항염 작용을 한다.1)또한 오메가-3 지방산은 오메가-6 지방산과 경쟁하는 것에 기인하여 3계열-, 5-계열 프로스타글란딘류, 트롬복산, 류코트리엔류,그리고 리폭신류를 포함한 arachidonic acid 유래 면역 및 염증매개체들의 생성물들을 감소시키는 쪽으로 조절된다.4,5) 천식일경우 arachidonic acid에서 주로 프로스타글란딘과 cysteinyl leu-kotrienes (CysLTs)이 생성되기 때문에 오메가-3는 천식의 예방과치료에 영향을 미친다.6)



Fig. 1. Molecular structure and empirical formula for 5 omega fatty acids.

오메가-3,6 지방산은 필수 지방산으로 식품을 통해서 섭취된다. 하지만 서구화된 현대 식단에 따른 과일과 채소 섭취의 감소와, 육류와 많은 가공 식품 섭취의 증가는 섭취되는 오메가-6의 비율을 증가 시키며 이는 천식을 포함한 여러 질병을 유발하는 원인이 된다.7) 기존 논문에 따르면, 오메가-6:오메가-3 지방산의 비율을 낮게 유지하는 것이 다양한 만성 질병을 예방할수 있다고 한다.7,8) 천식환자의 식이 변화를 통하여, 오메가3에대한 오메가6의 비율을 감소시켰을 때 메타콜린에 의한 호흡곤란이 개선되었다고 보고하였다.7,9) 또한 EPA와 DHA 등의 오메가-3가 다량 함유된 식품을 섭취 했을 때, 천식과 알러지 등 염증 반응이 완화되었다는 긍정적인 결과도 있다.10,11)

혈청 중의 오메가 지방산을 측정하기 위해서 가스 크로마토그래피(GC)12), 액체 크로마토그래피(HPLC)13), 핵자기 공명(NMR)14) 기기 등이 사용되어 왔다. 생체 시료 내 오메가 지방산을 검출할 때 과거에가장 많이 사용하는 것으로 보고된 기기는 GC이다. 하지만, GC는 trimethylaminoethyl (TMAE)나trimethylsilyl (TMS) 유도체화 같은 복잡한 전 처리 과정이 필요하며 이는 많은 시간과 노동력을 필요로 한다. HPLC는 전처리과정의 복잡성 외에도 장시간의 시료 전처리에 따른 불편함이존재하였으며 복잡한 유도체화 방법 등을 사용하므로 여전히 문제점이 존재하였다. 2000년대 이후 HPLC 방법보다 진보된 전자분무 이온화(electrospray ionization, 이하 ESI)를 사용한 LC-ESI-MS/MS 분석 및 다중이온모니터링(MRM)15,6) 모드를 이용한 오메가 지방산의 정량법이 보고되었다. 하지만 이 보고들도과정이 복잡한 화학적 유도체화를15) 이용하거나 전처리 과정에서 시간 소모가 많기 때문에 쉽게 접근하기 어려웠다.16)

최근에는 혈액 여지를 이용한 전처리법으로 오메가 지방산을분석한 방법이 보고되고 있다.17-20) 혈액이나 혈장, 혈청 시료는매우 복잡하여 일반적인 전처리로는 방해 물질 제거가 쉽지 않다. 혈액 여과지를 사용하면 기존의 전처리 과정에 비해 단순하면서도 불순물 제거가 매우 용이하기 때문에 유용한 대체 전처리방법으로 여겨진다.

본 연구에서는 복잡한 추출법이나 방사성 표지물질, 유도체화과정없이 이전의 논문 보고에서의 단점을 극복하면서도 (1) 국내에서는 최초로 혈청여지를 이용하여 UHPLC-MS/MS으로 오메가 지방산 분석을 하였으며 (2) 고가의 칼럼이 아닌 기존의C18 칼럼을 사용하면서 최적의 이동상을 선정하였고, (3) 국내 최초로 PUFA 여지를 이용한 오메가 지방산의 분석법을 확립하였고, (4) 건강한 사람과 천식환자의 혈청으로부터 오메가-3 지방산과 오메가-6 지방산을 정량하였으므로 이를 보고하고자 한다.

방 법(Methods)

시약 및 기기

오메가 지방산 표준품 중 alpha-linolenic acid (이하 ALA)은CSN Pharm (IL, USA)사로부터 그리고 docosapentaenoic acid (이하 DPA), docosahexaenoic acid (이하 DHA), arachidonic acid (이하 AA)은 Ambeed (IL, USA)사로부터 HPLC 등급으로 구입하였다. Eicosapentaenoic acid (이하 EPA)은 Tronto research chemicals (North York, CANADA)사로부터 구입하여 사용하였다. 오메가 지방산 내부표준품 중 d8-arachidonic acid (이하 d5-AA)은 Tronto research chemicals (North York, CANADA)사로부터, d5-EPA, d5-ALA, d5-DPA와 d5-DHA은 Cayman (AA, USA)사에서 HPLC 등급으로 구입하였다.

전처리 과정에서의 추출 용매 및 이동상으로 사용된 메탄올(이하 MeOH), 3차 증류수(이하 DDW)는 HPLC등급이며 덕산화학(Seoul, Korea)사에서 구입하였다. 아세토니트릴(이하 ACN), 암모늄 아세트산, 아이소프로판올(이하 IPA) 그리고 메틸삼차부틸에테르(methyl-tributylether 이하 MTBE), 클로로포름(이하 CHCl3)은 대정화학(Siheung, Korea)사에서 구입하였다. Butylated hydroxy toluene는 Sigma사(MA, USA)에서 구입하였다.

혈장의 보존 및 간섭물질 제거를 위해 전처리 과정에서 사용한 PUFA coatTM paper (이하 PUFA 여지)를 Xerion Limited (VIC, Australia)사로부터 제공받았다. 전처리 마지막 단계에 제단백 및 여과에 사용된 centrifuge tube filter는 Corning (NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 30% 소 혈청 알부민(30% bovine serum albumin)은 Sigma사(MA, USA)로부터 구입하였고,이를 희석한 2% bovine serum albumin를 surrogate matrix로 사용하였다. Vortex는 Ohaus사(NJ, USA)로부터 구입하여 시료 전처리에 사용하였다. 탠덤질량분석기의 분무기체(nebulizer gas),건조가스(dring gas), 충돌가스(collision gas)에 사용된 초고순도압축 액체 질소(liquid nitrogen, 99.999%)는 유진가스 사(Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.

Ultra high-performance liquid chromatography

초고성능 액체크로마토그래피(ultra high-performance liquid chro-matography, UHPLC) 및 펌프는 Shimadzu사의 Nexera X2 LC-30AD 모델과 함께 SIL-30AC autosampler를 사용하였다. 칼럼은시마즈(Shimadzu)사의 Shim-pack GIST C18 (2.1×50 mm I.D, 2 μM) (GL Science, Japan)을 사용하였으며, 칼럼 온도는 40°C로유지하였고, 칼럼 유속은 0.32 mL/min이었다. 시료 주입 부피는1μL로 선택되었다.

이동상 A는 10 mM 암모늄 아세트산을 포함한 30% MeOH을사용했고, 이동상 B는 10 mM 암모늄 아세트산을 포함한 60%IPA, 30% MeOH, 10% DDW을 사용하였다. 농도 구배 조건은다음과 같다. 이동상 B의 용매 조성을 70%에서 시작하여 1.5분간 유지시키고 98%의 비율로 4분까지 증가시킨 후 1분 동안 유지한다. 1분간 초기 조성인 이동상 B 70%로 다시 복귀하여 1분 동안 농도 평형을 유지함으로써 분석을 마친다. 총 농도구배분석 시간은 평형 시간을 포함하여 7분이다.

UHPLC-ESI-MS/MS 분석조건

이온화 방법으로는 ESI을 사용하였으며, Shimadzu사(Kyoto, JAPAN)의 MS/MS 8040 triple quadrupole 모델을 사용하였다. ESI-MS/MS의 조건은 다음과 같다. 이온화 모드는 negative ion-ization mode를 사용하였다. 스캔모드에서 어미 이온(parent ion)으로부터의 딸 이온(daughter ion) 정보를 최적 이온화시스템을 통해 얻었으며, MRM (multiple reacation monitoring) 모드에서정량하였다. 얻어진 모든 데이터와 크로마토그램상의 피크 면적을 이용한 계산은 Lab solution 프로그램(Shimadzu, Japan)을 이용하여 분석하였다.

오메가 지방산의 분석을 위한 최적의 MS/MS 기기 조건은interface voltage; 4.5 kV, nebulizer gas (N2) flow; 3 L/min, dry-ing gas flow; 15 L/min, dissolution line temperature; 250°C, heatblock temperature (N2); 400°C, collision-induced dissocia-tion gas (argon gas); 230 Kpa, detector voltage; −2.04 kV이었으며 각 분석물질의 선택이온과 머무름시간, MRM transition, col-lision energy (CE)는 Table 1에 나타내었다.

UHPLC-MS/MS parameter for omega fatty acids studied

Analyte RT(min) Molecular mass MRM transition CE(V)

α-linolenic acid(ALA) 2.67 278.48 277.20 / 277.20 14
Eicosapentaenoic acid(EPA) 2.70 302.45 301.10 / 257.30 11
Docosahexaenoic acid(DHA) 3.20 328.49 327.00 / 283.15 10
Arachidonic acid(AA) 3.28 304.48 303.20 / 259.25 11
Docosapentaenoic acid(DPA) 3.73 330.50 329.10 / 285.25 11

Internal standards IS MRM transition

α-linolenic acid-d5 2.67 283.48 281.20 / 264.25 18
Eicosapentaenoic acid-d5 2.66 306.10 306.10 / 262.25 10
Docosahexaenoic acid-d5 3.17 332.49 332.00 / 288.15 10
Arachidonic acid-d8 3.24 312.50 311.00 / 267.20 12
Docosapentaenoic acid-d5 3.70 335.50 334.10 / 290.30 15


혈청 검체

본 연구에 사용된 통합 혈청은 10명의 건강한 사람의 정상 혈청으로부터 조제되었다. 2명의 정상 혈청과 3명의 천식 환자 혈청이 별도의 임상 시료 적용을 위하여 개별적인 혈청으로 준비되었다. 모든 혈청 검체는 한양대학교 의과대학에서 IRB 승인(IRB No. HYI-18-227-1)을 받은 후 제공 받았으며 폴리에틸렌튜브 내의 혈청검체는 받은 즉시 −20ºC에서 보관하였고, 분석직전 녹여서 사용하였다.

혈청 중 오메가 지방산의 정량

표준용액 제조: Stock standard solution의 조제(10 mg/mL)는 냉동 보관하였던 오메가 지방산 5종의 표준품을 클로로포름:메탄올(=3:1 v/v)에 녹여 조제한 후 glass vial에 냉동 보관하였다. Working standard solution의 제조는 Stock solution (10 mg/mL)을2% bovine serum albumin과 메탄올로 희석하여 조제하였다. AA는 PUFA 여지 전처리 과정 후 오메가 지방산의 농도가 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 및 5µg/mL의 8가지의 다른 농도가되도록 희석하여 조제하였고, DHA 및 DPA은 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 및 2.5 µg/mL의 7가지의 다른 농도, ALA 및 EPA은 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 및 2.5 µg/mL의 6가지의 다른 농도가되도록 희석하여 조제한 후 사용하였다.



Fig. 10. Scheme 1. Schematic diagram of sample preparation with filter papers for omega fatty acids.

Stock internal standard solution의 조제 (1 mg/mL)는 냉장 보관된 내부표준품(ALA-d5, EPA-d5, DHA-d5, AA-d5, DPA-d5)을 메탄올에 녹여 농도를 1mg/mL로 조제하였고, working internal stan-dard 용액은 stock internal standard solution을 메탄올로 희석하여농도를 10 µg/mL로 조제하여 사용하였다.

PUFA 여지를 이용한 검량선 작성: 검량선용 표준액은 2%bovine serum albumin과 메탄올로 희석하여 PUFA 여지 전처리과정 후 오메가 지방산의 농도가 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5, 1, 2.5,및 5µg/mL의 농도가 되도록 조제하였다.

서로 다른 농도로 조제된 오메가 지방산의 표준용액 30 µL를PUFA 여지에 처리하였고 밤새 상온에서 건조시켰다. 완전히 건조 후, 6 mm punch를 이용하여 PUFA 여지에 4개의 구멍을 뚫고 핀셋을 이용해 Eppendorf tube로 옮겼다. 이후 내부표준물질혼합액(ALA-d5; 0.25 µg/mL, EPA-d5; 0.25 µg/mL, DHA-d5; 0.5 µg/mL, AA-d5; 0.5 µg/mL, DPA-d5; 0.5 µg/mL) 이 포함된 추출 용매(MTBE:MeOH:DDW=3:2:1) 130 µL를 가하였다. Eppendorf tube 내의 모든 혼액을 vortex mix로 잘 섞은 후(15,300 rpm, 30분), 오메가 지방산이 녹아 있는 추출용매를 전부 centrifuge tube filter로 옮겼다. Centrifuge tube filter에 있던 추출용매를 원심분리기를 이용하여 필터를 여과시켰다(6000 rpm, 1 min). 이 여과액을 insert가 들어간 autosampler 용 유리 바이알에 옮겼고, 이중 1µL를 주입하여 UHPLC-ESI-MS/MS로 분석하였다(Scheme 1). 여기서 얻은 내부표준물질의 농도에 대한 오메가 지방산의농도의 비를 x축으로 놓고, 내부표준물질의 피크 면적에 대한오메가 지방산의 피크 면적의 비를 y축으로 하여 검량선을 작성하였다(Table 2, Fig. 7).

Quantification parameters for omega fatty acid standards spiked on 2% Bovine serum albumin

Compounds Range (µg/mL) Equation R2 LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL)
α-linolenic acidα-linolenic acid(ALA) 0.1 – 2.5 Y = 0.7242X - 0.0949 0.9981 0.01 0.03
Eicosapentaenoic acidEicosapentaenoic acid(EPA) 0.1 – 2.5 Y = 0.0284X - 0.0023 0.9994 0.05 0.1
Docosahexaenoic acidDocosahexaenoic acid(DHA) 0.05 – 2.5 Y = 0.2031X - 0.0065 0.9947 0.005 0.03
Arachidonic acidArachidonic acid(AA) 0.05 – 5 Y = 0.0126X - 0.001 0.9989 0.01 0.03
Docosapentaenoic acidDocosapentaenoic acid(DPA) 0.05 – 2.5 Y = 1.7530X - 0.0249 0.9994 0.01 0.03


밸리데이션: US Food and Drug Administration (FDA) 밸리데이션 지침서를 따라서 검증하였다. 신호(S)과 신호잡음(N)을 이용하여 분석물질의 검출한계는 S/N 비가 3이 되는 농도에서 결정하였고, 분석물질의 정량한계는 S/N 비가 10이 되는 농도에서 결정하였다.



Fig. 2. ESI-MS/MS TIC chromatogram of omega fatty acids. The peak identifies as a; ALA, b; EPA. c; DHA, d; AA and e; DPA



Fig. 3. Daughter ion of omega fatty acids. The peak identifies as A; ALA, B; EPA. C; DHA, D; AA and D; DPA

정확도와 정밀도는 QC sample을 3회 반복 측정하여 얻었다. 저농도(0.2 µg/mL), 중농도(0.5 µg/mL)에서 각각 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

[measured concentration]/[apparent concentration]×100%

정밀도(precision)는 변동계수(relative standard deviation, RSD%)로서 표현하였다.

PUFA 여지를 이용한 혈청 시료 분석: 사람 혈청 30 µL를PUFA 여지에 처리한 후 밤새 상온에서 건조시켰다. 완전히 건조 후, 6 mm punch를 이용하여 PUFA 여지에 4개의 구멍을 뚫었고, 핀셋을 이용하여 Eppendorf tube로 옮겼다. Eppendorf tube에 내부표준물질 혼합액(ALA-d5; 0.25 µg/mL, EPA-d5; 0.25 µg/mL, DHA-d5; 0.5 µg/mL, AA-d5; 0.5 µg/mL, DPA-d5; 0.5 µg/mL) 이 포함된 추출용매(MTBE:MeOH:DDW=3:2:1) 130 µL를가하였다. Eppendorf tube 내의 모든 혼액을 vortex mix로 잘 섞은 후(15,300 rpm, 30분), 오메가 지방산이 녹아 있는 추출용매를 centrifuge tube filter로 옮겼다. Centrifuge tube filter에 있던 추출용매를 원심분리기를 이용하여 필터를 여과시켰다(6000 rpm, 1min). 이 여과액을 insert가 들어간 autosampler용 유리 바이알에 옮겨 이 중 1µL를 주입하여 UHPLC-ESI-MS/MS로 분석하였다(Scheme 1). 여기서 얻은 내부표준물질의 농도에 대한 오메가 지방산의 농도의 비를 x축으로 놓고, 내부표준물질의 피크면적에 대한 오메가 지방산의 피크 면적의 비를 y축으로 하여혈청 시료를 정량하였다.

결 과(Results)

본 연구에서는 오메가 지방산을 trimethylaminoethyl (TMAE)나 trimethylsilyl (TMS) 유도체화 같은 복잡한 전 처리 과정이전혀 필요 없이, PUFA 여지에서 오메가 지방산을 추출하였다. ESI-MS/MS의 음이온을 얻는 MRM 모드를 사용하여 동시 분석하는 신속하고 저렴하며 감도 높은 정량법을 개발하였다. 오메가 지방산 5종을 스캔하여 전체 스펙트럼을 얻은 후 최적화된MRM transition 이온들을 Table 1과 같이 선정하였다. MRM 모드의 정량을 위해 선정된 MRM transition으로는 ALA은 m/z= 277.20/277.20, EPA은 m/z=301.10/257.30, DHA은 m/z=327.00/ 283.15, AA은 m/z=303.20/259.25 그리고 DPA은 m/z=329.10/ 285.25을 적용하여 MRM 모니터링 및 정량을 실시하였다(Table 1).

최적 분석조건 확립과 밸리데이션

서로 다른 3가지 종류의 혈액 여과지에(Whatman 903, Advantec, PUFA 여지) 통합 혈장을 처리 후, 각각에 대한 회수율을비교하였고 회수율이 가장 좋은 PUFA 여지를 선정하였다. 처리한 여지(filter paper)로 비교한 통합혈장의 최종 부피는 10 μL이었다. 각각의 오메가 지방산에 대하여 피크 면적을 비교하여, 감도가 가장 좋은 최적의 혈액 여과지인 PUFA 여지를 선정하였다(Fig. 4).



Fig. 4. Extraction efficiency on 3 different filter papers for omega fatty acids.

오메가 지방산을 혈액 여과지로 분석한 기존 논문17,18)은 메탄올을 사용하였다. 본 연구는 분석 물질이 비극성이라는 특징을고려하여 메틸삼차부틸에테르를 추가하여 실험을 해보았다. 총4종의 추출 용매(MTBE:MeOH:DDW=3:2:1, MTBE:MeOH:DDW =2:2:2, MeOH 80%, MTBE:MeOH:DDW=1:2:3)를 사용하여 전처리를 한 후, 각각의 오메가 지방산에 대한 피크 면적을 비교하였다. 추출 용매 MTBE:MeOH:DDW=3:2:1인 경우가 5종의오메가지방산의 감도와 추출 효율이 매우 우수하여 최적의 추출용매로 선정하였다(Fig. 5).



Fig. 5. Extraction efficiency on 4 different solvent systems for omega fatty acids. A; MTBE:MeOH:DDW=3:2:1, B; MTBE: MeOH:DDW=2:2:2, C; MeOH 80%, D; MTBE:MeOH:DDW= 1:2:3

오메가 지방산을 5분 이내에 신속하면서도 최적의 분석 조건을 확립하기 위해 이동상 조건은 기존의 보고된 논문17,23-25)에 기초하여 4가지 다른 종류의 이동상을 토대로 머무름 시간과 감도를 비교하여 선정하였다(Fig. 6). Fig. 6의 첫번째 이동상이 크로마토그램 상에서 대칭인 피크이면서 꼬리끌기가 없으며 감도가 가장 우수한 이동상임을 확인할 수 있었다.



Fig. 6. Total ion chromatograms (TIC) and MRM ions of 5 omega fatty acids on 5 different mobile phase. (A) mobile phase A; 10 mM ammonium acetate in 30% methanol, mobile phase B; 10 mM ammonium acetate in 60% isopropyl alchol, 30% methanol and 10% DDW (B) mobile phase A; 20 mM ammonium acetate in 30% methanol, mobile phase B; 20 mM ammonium acetate in 60% isopropyl alchol, 30% methanol and 10% DDW (C) 2 mM ammonium acetate in 90% acetonitrile and 10% DDW (D) mobile phase A; 5mM ammonium acetate in DDW, mobile phase B; acetonitrile, (E) mobile phase A; 0.05% formic acid in 50% acetonitrile, mobile phase B; 0.05% formic acid in 100% acetonitrile. The peak number refer to Fig. 2.

최적 조건의 PUFA 여지, 추출용매 그리고 가장 적합한 이동상을 선정하여 최적 분석조건을 확립한 후 본 연구의 분석방법을 적용하였을 때 농도 범위가 각각 ALA; 0.1-2.5 µg/mL, EPA; 0.1-2.5 µg/mL, DHA; 0.05-2.5 µg/mL, AA; 0.05-5 µg/mL, DPA; 0.05-2.5 µg/mL 일 때, 직선성에 대한 결정계수가 ALA (R2= 0.9981), EPA (R2=0.9994), DHA (R2=0.9947), AA (R2=0.9989)그리고 DPA (R2=0.9994) 모두에서 매우 뛰어난 직선성을 보여주었다(Table 2, Fig. 7). 사람의 혈액을 혈액 여과지로 전처리하여 오메가 지방산을 정량 분석한 타 논문17,20)들의 정량한계 및검출한계 농도의 결과를 본 연구의 결과와 비교하였다(Table 4).혈액 여과지에 혈청을 처리하여 오메가 지방산을 분석한 보고연구가 이전에 없었기 때문에, 혈액을 분석한 논문과 비교를 하였다. 본 연구에서 개발된 방법인 UHPLC-ESI-MS/MS의 최적분석조건 확립 후 계산된 LOD, LOQ (Table 2)는 기존의 보고된 감도보다 더 우수함을 보여주었다.

Comparison of LOD and LOQ

References Sample matrix Sample preparation LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL)
Our study Human serum dried serum spot 0.005-0.01 0.03-0.1
201717) Human blood dried blood spot 0.05-0.1 0.2-0.3
201320) Human blood dried blood spot 0.01-0.1 0.03-0.65




Fig. 7. Calibration curves of 5 omega fatty acids using UPLC-MS/MS analysis.

분석법의 밸리데이션을 위하여 정확도와 정밀도를 얻기 위하여 저농도, 중간농도 2가지 다른 농도의 표준품을 2% bovine serum albumin 소 혈청 알부민에 첨가하여 정밀도와 정확도를계상하였다(n=3). 5 종의 오메가 지방산의 경우 정확도는 92.6-110.4%이며, 정밀도는 0.2-9.6% 이내로 오메가 지방산은 모두 매우 양호한 정확도와 정밀도의 결과를 보였다(Table 3).

Accuracy and precision for recovery


Compounds Concentration addeda Concentration detecteda Recovery ± RSD (%)
α-linolenic acidα-linolenic acid(ALA) 0.2 0.20 97.9 ± 9.6
0.5 0.47 93.5 ± 2.7

Eicosapentaenoic acidEicosapentaenoic acid(EPA) 0.2 0.19 94.6 ± 2.9
0.5 0.53 106.5 ± 1.7

Docosahexaenoic acidDocosahexaenoic acid(DHA) 0.2 0.19 93.1 ± 6.8
0.5 0.55 110.4 ± 0.9

Arachidonic acidArachidonic acid(AA) 0.2 0.19 92.6 ± 1.9
0.5 0.53 105.2 ± 0.2

Docosapentaenoic acidDocosapentaenoic acid(DPA) 0.2 0.20 101.7 ± 3.3
0.5 0.55 109.8 ± 4.0

aexpressed in μg/mL (n=3)



PUFA 여지를 이용한 혈청 중 오메가 지방산의 정량

2% 소 혈청 알부민에 오메가 지방산의 표준품을 첨가하고 고르게 섞은 후, PUFA 여지에 처리한 분석방법으로 3회 반복 측정하였을 때 오메가 지방산의 피크는 4분 이내의 매우 빠른 머무름 시간을 보여주었다. MRM 상에서의 크로마토그램을 비교해 보면 공시료(Fig. 8A), 2% 소 혈청 알부민에 표준용액을 첨가한 것(Fig. 8C), 건강한 사람의 혈청(Fig. 8D), 천식 환자의 혈청(Fig. 8E)에서 오메가 지방산이 matrix effect 없이 우수한 감도의 크로마토그램을 보여주었다.



Fig. 8. Total ion chromatograms (TIC) of omega fatty acids standards on different matrix. (A) blank, (B) internal standards on blank, (C) standard spiked to bovine serum albumin, (D) human healthy subject serum, (E) human serum with asthma The peak identifies as a; ALA, b; EPA. c; DHA, d; AA, e; DPA, a′; ALA-d5, b′; EPA-d5, c′; DHA-d5, d′; AA-d8 and e′; DPA-d5

또한 건강한 2명의 혈청과 천식환자 3명의 혈청 오메가 지방산의 양을 정량하고, 각각의 물질에 대하여 정상군과 천식 환자군을 비교하여 보았다. 오메가-6 지방산 중 AA의 평균농도는천식 환자군이 정상군 보다 약 1.75배 높은 수준을 보였으며, 반면 오메가-3 지방산 중 ALA, EPA, DHA, DPA는 정상환자의 농도가 천식 환자보다 각 1.12, 1.1, 1.12, 0.95배 높았다. 본 결과를 발전시키면 오메가 지방산을 정상인과 천식 환자를 구별할수 있는 바이오 마커로서의 파라미터로 적절하게 응용할 수 있을 것이라고 여겨진다(Fig. 9).



Fig. 9. Serum omega fatty acids concentration in normal controls (n=2) and asthma patients (n=3).

고 찰(Discussion)

LC-ESI-MS/MS를 이용한 혈청이나 혈장 내 지질, 인지질, 지방산 등과 같은 내인성 물질을 분석을 하는 경우 주로 액체-액체 추출법, 고체상추출법을 사용하거나 극미량의 농도로 존재하는 물질의 경우에는 농축과 같은 전처리가 사용되었다.15-16) 혈청이나 혈장을 분석할 경우 시료는 매우 복잡하여 일반적인 전처리로는 방해 물질 제거가 쉽지 않다. 특히 전자분무이온화 방식에서는 이러한 방해 물질은 이온의 억제 효과를 일으키는 원인이 되고있다. 혈액 여과지를 사용하면 불순물 제거가 매우 용이하고, 기존의 액체-액체 추출법이나 고체상추출법 전처리 과정에 비해 단순하기 때문에 유용한 기존방법의 대체방법으로 사용될 수 있다. 특히 본 연구에서는 산화방지제인 butylated hydroxytoluene를 사전에 처리하여 사용하는 혈액 여과지를 이용한 타 논문21,22)과 달리, butylated hydroxytoluene가 이미 혈액여과지에 처리되어 있는 PUFA 여지를 사용하여 분석 전처리시간과 노동력이 절약되었으며 결과의 재현성이 뛰어났다. 또한 서로 다른 3가지 종류의 혈액여과지(Whatman 903, Advantec, PUFA 여지)를 비교한 결과, PUFA 여지가 가장 추출 효율이 우수하였다(Fig. 3).

최적의 추출용매를 선정하기 위하여 총 4종류의 추출용매별회수율을 비교하였다. Hewawasam E et al.17)의 연구에서 5종의추출용매를 비교하였고 그 중 80% MeOH이 가장 우수한 추출용매로 선정되었다. 본 연구에서는 분석물질의 비극성 성질을고려하여 메틸삼차부틸을 메탄올, 증류수와 혼합하여 사용하였다. 2회의 반복실험을 하였고 추출 효율은 피크 면적을 비교하여 확인하였다. 실험결과 총 4종의 추출용매 중 MTBE:MeOH: DDW (3:2:1, v/v)가 가장 우수한 감도를 보여주었다(Fig. 4).

본 연구에서는 기존 논문에 사용된 이동상 4종과17,23-25) 기존의 이동상23)을 수정한 1종에 대한 비교를 하였다(Fig. 5). Fig. 5에서 두번째 이동상23)에 사용되었던 20 mM의 암모늄 아세트산을 10 mM 암모늄 아세트산으로 감소시켜 사용한 것이 첫번째이동상이다. 첫 번째 이동상은 추출효율이나 피크강도 피크모양이 모두 양호하였으며 바탕선이 깔끔해졌으므로 최종 이동상으로 선정하였다. 모든 분석물질은 4분 이내에 신속하게 용출되면서, 대칭을 이루는 피크를 보여주고 있다.

오메가-3 지방산은 주로 등푸른 생선, 견과류, 해산물, 녹색 식물 등에 함유되어있다.3,4) 대표적인 omega-3에는 ALA, EPA, DHA, DPA가 있다. Miyata J et al.1)에 따르면 오메가-3 지방산은 사이토카인(cytokine)의 생산 및 지질 전달자(lipid mediators)의 방출작용 등 여러가지 항염적 작용에 영향을 미친다. EPA와 DHA는 항염 특성을 지닌 아이코사노이드인 프로스타글란딘E3 (prostaglandin E3), 류코트리엔 B5 (leukotriene B5)의 전구체이다. 또한 효소 시클로옥시지나제(COX; cyclooxygenase) 또는리포옥시게나제(LOXs; Lipoxygenases)를 통해 염증 해소 촉진전달자(SPM; Specialized Pro-resolving Mediators)를 생성한다. 오메가-3 지방산이 생성하는 SPM에는 protectin, resolvins, maresins이 있으며, 기도 내 호산구 염증을 조절하며, 체내 염증 해소를촉진하는 역할을 한다.3,4,27)

오메가-6 지방산은 가공식품, 마가린에 많이 포함되어있다.3,4) AA는 대표적인 오메가-6 지방산으로, 서양식 음식에 풍부하게함유되어 있다. AA는 전염증성 아이코사노이드인 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin E2), 류코트리엔 B4 (leukotriene B4), 리폭신A4 (Lipoxin A4)의 전구체이다. 이 물질은 강력한 기관지 수축제로 작용될 수 있으며 알레르기 질환에서 전염증성 특성을 나타낸다.26,28,29)

천식 환자와 정상 군에 따른 오메가-3,6 지방산의 농도 차이와 효과 차이에 관한 보고된 연구결과들은 현재 논란이 많으며결론에 도달하지 않은 상태이다. Linette et al.10)의 보고에서는오메가 지방산의 섭취로 오메가-3 지방산이 증가하자, 염증성 물질이 감소하고 천식 증상이 개선되었다고 보고한다. Fussbroich30)에 따르면 천식 환자의 경우 오메가-6 지방산인 AA가 중가하였다. Kitz et al.31)의 연구결과는 천식 환자군에서 오메가-6가 오메가-3보다 더 많은 양이 존재한다고 보고한다. 반면, Stoodley6)의 경우 O3I (Omega-3 Index; sum of EPA and DPA)가 정상군보다 천식환자군에서 더 높게 나옴을 보여주고 있다. Shahieda,26) Prasad32)은 오메가 지방산의 섭취는 천식 환자들에게 아무런 영향도 없었다고 결론 지었다.

본 연구는 정상군 2명의 혈청과 천식 환자군 3명의 혈청 중오메가 지방산 5종의 양을 정량하였다. 오메가-6 지방산 중 AA의 평균농도는 천식 환자군이 정상군 보다 약 1.75배 높은 수준을 보였다. 이는 Fussbroich et al.,30) Bolte et al.34)와 유사한 결과를 보였다. Fussbroich et al.30)은 천식 실험 쥐의 혈액과 폐세포에서의 AA의 농도가 상당히 증가하였음을 보여준다. 염증이발생할 경우, 효소 phosphatidylcholin-2-acylhydrases (PLA2)에 의해 세포막의 인지질로 부터 AA가 생성되므로 혈중에 AA 농도가 높아지게 된다. Bolte et al.34)에 따르면 천식 환자의 AA 수치가 높아진 것은 오메가-6 의 신진대사의 균형이 흐트러졌기때문이거나, 환자들의 염증반응에 부수적으로 생성 된 것일 수도 있다.

반면 오메가-3 지방산 중 ALA, EPA, DHA, DPA는 정상환자의 농도가 천식 환자보다 각 1.12, 1.1, 1.12, 0.95배 높았다. 이는 Calder et al.33)의 결과와 같다. Calder et al.에 따르면, 오메가-3 지방산은 AA의 아이코사노이드인 프로스타글란딘, 류코트리엔의 생성, 염증성 사이토카인의 생성등의 염증 반응을 억제한다. 또한 세포막의 지방산의 구성은 EPA와 DHA의 추가적인섭취를 통해 변할 수 있다. 즉, 염증반응을 유도하는 AA보다resolvins, protectins와 같은 항염물질을 방출하는 EPA, DHA의비율이 커지면 염증의 정도가 개선됨을 보여준다.

본 연구에서는 혈청 중 오메가-3 지방산과 오메가-6지방산에대한 정성 정량 분석법을 검증하였다. 추후 본 연구를 확대하여좀 더 광범위한 생체시료에 적용함으로써 실제 임상적으로 활용가능한 대사체 기반 진단 예측 플랫폼으로 응용할 수 있도록확장하고자 한다.

결 론(Conclusion)

본 연구는 기존의 LLE나 SPE와 같은 전처리와 달리 혈액 여과지를 이용하여 시간, 비용, 노동력을 절약하는 것을 특징으로한다. 또한 이동상, 추출 용매를 새로 수정하여 개발하였으며UHPLC-MS/MS를 이용하여 신속하고 감도 높게 혈청 중 오메가 지방산 5종의 동시분석 정량법을 개발하였다. 개발한 오메가지방산의 동시분석법은 기존의 논문에 비하여 우수한 정량 한계를 보였으며, 실제 임상 시료인 혈청에 적용이 가능함을 확인할 수 있었다. 추후 천식의 발생과 치료효과에 오메가 지방산의영향을 파악 하기 위해서, 더 광범위한 생체시료에 대한 적용이필요할 것으로 생각된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 보건장학회의 지원으로 수행되었음. PUFA coatTM paper를 제공한 Xerion Limited 회사와 임상검체를 제공하여 주신 한양대학교병원 내과 김상헌 교수님께 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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August 2021, 65 (4)
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