search for




 

Effects of 20(R)-Ginsenoside Rg3 and 20(S)-Ginsenoside Rg3 on the migration and invasion of HaCaT cells
Yakhak Hoeji 2021;65(2):65-71
Published online April 30, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Sang-Won Kim*, Young-Chan Noh*, So-Yeon Park*, Mijin Lee*,Hui-Ji Choi**, Gyu-Yong Song**,#, and Hangun Kim*,#

*College of Pharmacy, Sunchon National University
**College of Pharmacy, Chungnam National University
Correspondence to: Hangun Kim, College of Pharmacy, Sunchon National University, 255, Jungang-ro, Suncheon-si,, Jeollanam-do, Republic of Korea
Tel: +82-61-750-3761
Fax: +82-61-750-3708
E-mail: hangunkim@sunchon.ac.kr

Gyu-Yong Song, College of Pharmacy, Chungnam National University, 99, Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon, Republic of Korea
Tel: +82-42-821-5926
Fax: +82-42-823-6566
E-mail: gysong@cun.ac.kr
Received November 5, 2020; Revised December 29, 2020; Accepted January 4, 2021.
Abstract
Wound healing in the skin is a complex process involving several steps. First is the inflammation stage, in which the wound causes constriction of damaged blood vessels and the aggregation of platelets, aiding neutrophils and macrophages in removing the damaged tissue and preventing infection. This is followed by the proliferation stage involving keratinocytes and fibroblasts. Finally, in the tissue remodeling stage, the wound healing process is completed through contraction of the wound area, which promotes the growth of new tissue. In particular, the migration of keratinocytes and fibroblasts during the proliferation stage to the wound site and penetration of these cells into the surrounding tissues promote the wound healing process. In this study, we performed MTT assays to evaluate the toxicity of 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3, stereoisomers of ginsenoside Rg3, an active ingredient of Korean ginseng, on the keratinocytes and fibroblasts involved in the proliferation stage. Migration assays, invasion assays, and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) were used to assess the expression of genes related to wound healing. We observed that 20(R)-Rg3 was non-toxic and promoted the expression of COL1A2 and ACTC1, genes related to wound healing, thereby increasing the mobility and invasiveness of keratinocytes. In addition, we confirmed that 20(R)-Rg3 increased the initial rate of wound healing in vivo in BALB/c mice. The positive effect of 20(R)-Rg3 on wound healing can be assessed by separating this isomer from 20(S)-Rg3, which has moderate toxicity against keratinocytes and reduces mobility and invasiveness. Thus, 20(R)-Rg3 optical isomers could be potential candidates for the development of effective wound healing medicines.
Keywords : Ginsenoside Rg3, 20(R)-Rg3, HaCaT, Wound healing
서 론(Introduction)

상처가 발생하게 되면 우리 몸에서는 즉시 상처치유과정이 진행된다. 모든 상처에서 발생하는 과정은 단계별로 다음과 같다. 첫 번째, 염증단계에서는 상처 초기 혈관 파괴에 의해서 혈소판이 응집하여 지혈 효과를 나타낸다. 혈소판은 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF),1) 형질전환증식인자β(transforming growth factor-β TGF-β), 상피세포증식인자(epidermalgrowth factor, EGF) 등의 성장인자들을 분비하며 상처치유과정을 시작하고 호중구와 대식세포에 의해서 세균의 감염이 방지되며 손상된 조직들이 제거된다. 두 번째, 증식단계에서는 염증단계를 거쳐 깨끗해진 상처부위로 각질세포와 섬유아세포가 이동하여 증식하면서 콜라겐을 합성한다. 그 과정에서 혈관이 형성되고 육아조직이 형성된다. 또한 상처가 아물면서 상피화가 진행된다. 세 번째, 재형성단계는 상처치유의 마지막 단계로 새로운 상피와 최종적으로 상처 부위의 조직이 형성된다. 콜라겐과 세포외기질이 회복되며 1~2년 정도 걸리면서 상처 피부 부위가 정상화되면서 탄력을 회복한다.2)

따라서 상처치유과정에서 섬유아세포와 각질세포는 상처부위로의 이동(migration)과 조직 내 세포 외 기질을 통과하여 이동 또는 인접한 조직으로의 이동인 침투(invasion) 과정이 필수적이다. 특정 후보 물질이 상처부위에 독성을 가지지 않으면서 섬유아세포와 각질세포의 이동과 침투 능력을 향상시킨다면, 상처치유과정을 촉진시킬 수 있을 것이라 생각했다.

우리나라에서 재배되는 고려인삼은 다양한 약리활성을 가지면서 생체기능조절을 위한 생약으로 역사적으로 오랜 기간 동안 활용되었다.3) 그러한 활성들을 가지게 하는 주요 활성성분은 진세노사이드(ginsenoside)이다. 본 연구에서는 다양한 진세노사이드 중 Rg3를 사용했다. Rg3는 최근까지 다양한 연구들을 통해 혈당조절,4) 항암,5,6) 간 보호7) 등에도 효과를 보인다고 알려 졌다. Rg3는 라세미혼합물로 존재한다. 같은 Rg3일지라도, 광학 활성에 따라서 다른 약리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.8)본 연구자들은 R형(20(R)-Rg3)과 S형(20(S)-Rg3)가 각질세포, 섬유아세포에 세포 독성을 나타내는 정도를 파악하고 이동과 침투에 미치는 수준을 측정하면서 창상치유과정에 활성을 가지는지 평가하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Structure of ginsenoside Rg3. Determination of stereoisomers of 20(R)-ginsenoside Rg3 and 20(S)-ginsenoside Rg3, based on the arrangement of the hydroxyl group (OH) at the C-20 position of the non-sugar part.
방 법(Methods)

20(R)-Ginsenoside Rg3 및 20(S)-Ginsenoside Rg3

20(R)-Ginsenoside Rg3 및 20(S)-Ginsenoside Rg3는 아레즈(주)에서 공급받아 실험에 사용하였다.

세포 독성 분석

HaCaT와 NIH3T3 세포(각각 2.5 × 103 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 파종하고 24시간 동안 성장시킨 다음 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3를 100~12.5 μM의 농도로 처리해주었다. 48시간 뒤에 37°C에서 MTT reagent를 처리하고 4시간 동안 배양 한 후 DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세포를 용해시키고 Gen 5 (2.03.1) software (BioTek Eon, Winsooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.9)

세포 이동성 분석

세포의 이동 능력은 Boyden chamber assay (Life Sciences, Corning, NY, USA)로 측정하였다. 각 챔버의 상부에는 FBS를 함유하지 않는 DMEM 배지에서 5.0 × 105개의 HaCaT, 1.0 × 106개의 NIH3T3 세포를 배양하였다. 이어서 5% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 하부 챔버에 첨가하여 화학 유인 물질로써 사용하였다. 14~16시간 동안 세포를 안정화 시킨 후에. 각각의 세포에 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3를 28, 14, 7, 3.5 μM 처리해 주었다. 이 후 추가적으로 24시간 동안 안정화 시킨 후, 상부 챔버의 세포를 Diff Quik 키트(Sysmex, Japan)로 고정시켰다. 이어서, 면봉으로 막 내부의 세포를 기계적으로 제거하고, 막의 하부에 부착된 세포를 염색하고 챔버 당 왼쪽, 오른쪽의 위, 아래 구역과 가운데 구역을 선택하여 총 5구역을 광학 현미경을 이용하여 분석하였다.

세포 침윤성 분석

세포의 침윤성은 Boyden chamber assay (Life Sciences, Corning, NY, USA)로 측정하였다. 1%의 젤라틴으로 8 μM 구멍 사이즈의 폴리카보네이트 막으로 이루어진 상부 챔버를 코팅하였다. 각 챔버의 상부에는 FBS를 함유하지 않는 DMEM 배지에서 2.0 × 105개의 Caco2, 5.0 × 105개의 HaCaT 세포를 배양하였다. 이어서 5% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 하부 챔버에 첨가하여 화학 유인 물질로써 사용하였다. 14~16시간 동안 세포를 안정화 시킨 후에. 각각의 세포에 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3를 28, 14, 7, 3.5 μM 처리해 주었다. 이 후 추가적으로 24시간 동안 안정화 시킨 후, 상부 챔버의 세포를 Diff Quik 키트(Sysmex, Japan)로 고정시켰다. 이어서, 면봉으로 막 내부의 세포를 기계적으로 제거하고, 막의 하부에 부착 된 세포를 염색하고 침습된 세포는 챔버 당 왼쪽, 오른쪽의 위, 아래 구역과 가운데 구역을 선택하여 총 5 구역을 광학 현미경을 이용하여 분석하였다.10)

정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(Quantitative real time PCR)

20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3 28 μM 시료가 처리된 각각의 세포 그룹으로부터 총 RNA (1 μg)을 M-MLV 역전사 효소 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 전환 시켰다.11) qRT- PCR 반응 및 분석은 SYBR green (Enzynomics, Korea) 및 CFX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 실험하였다. qRT-PCR에 사용된 유전자 및 프라이머는 Table 1에 정리하였다. 유전자 발현의 상대적인 차이는 GAPDH를 기준으로하여 ΔΔCt 방법으로 계산하였다.

List of genes and primer sequences subjected to Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

Name Gene primer
ACTC1 Actin, alpha, cardiac muscle 1 (forward) 5'-TACCCTGGTATTGCCGACC-3'
(reverse) 3'-GGACGATGGAAGGACCACTC-3'
COL1A2 Collagen, type I, alpha 2 (forward) 5'-CCTTTCTGCTCCTTTCTCCA-3'
(reverse) 5'-AGCAACACAGTTACACAAGG-3'
GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (forward) 5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3'
(reverse) 5'AGTTGTCATGGATGACCTTGGC--3'

Expression of ACT1 and COL1A2, genes that affect wound healing, was confirmed by qRT-PCR.



Avertin 제조법

쥐의 마취를 위해 사용한 Avertin은 기 보고된 참조논문 등의 방법에 따라 조제하였다. 제조 방법을 요약하여 설명하면 0.25 g의 Tribromo ethanol을 0.5 mL의 2-methyl-2-butanol에 용해시킨 solution을 미리 만들어 둔다. 빛을 차단한 상태에서 약 20 mL의 증류수에 미리 만들어 둔 solution을 혼합하여 40°C로 가열하며 600 rpm 2시간 교반하였다. 0.45 μM 시린지 필터(Sartorius Stedim Biotech, Germany)를 사용하여 교반액을 여과하였다. 여과가 끝난 용액은 pH검사를 진행하여 pH가 5보다 높은지 확인하였다. Final solution은 Amber tube에 등분하여 빛을 차단한 –4°C에서 14 일 이내로 보관하였다.

In-vivo wound healing assay

체중 20~25 g의 5주령 BALB/c 수컷 흰쥐를 (주)오리엔트 바이오에서 구입하여 일정한 조건(온도: 27.2°C, 습도: 60%, 12시 간 명암주기)에서 1주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험용 쥐의 경우, Avertin 250 mg/kg을 복강주사하여 마취시킨 후, 전기제모기로 창상을 만들 등 부위의 털을 상처가지 나지 않도록 주의하여 제거하였다. 털이 제거된 등 부위를 70% Ethanol 로 소독한 뒤, 등 부위에 일회용 펀치를 사용하여 지름 5 cm의 크기로 원형 창상을 4개/마리씩 유발하였다. 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3의 창상 치유 효과를 각각 비교하기 위하여, 대조군인 DMSO 를 사용하였다. 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3 100 μM, DMSO를 각각 PBS에 희석하여 5마리의 각각의 상처부위에 매일 도포하였다. 창상 치유 효과를 관찰하기 위해서 매일 상처로부터 일정한 높이에서 모든 상처들을 촬영하여 상처부위 면적을 Photoshop 프로그램을 이용하여 픽셀화하였다. 창상치유효과는 초기 상처의 크기에 대한 매일 상처의 크기의 백분율로 평가하였다.

통계 분석

실험 데이터의 수치들은 평균 ± 표준오차(Standard error of the mean, SEM)로 나타내었고, 통계학적인 비교는 unpaired “t-test” 로 이루어졌다. p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

HaCaT, NIH3T3 세포에 대한 20(R)-Rg3, 20(S)-Rg3의 독성

20(R)-Rg3, 20(S)-Rg3을 처리하였을 때, 상처부위 세포와 치유 에 관여하는 세포들에 독성을 가지지 않음을 확인하기 위하여 사람 각질형성세포 HaCaT와 쥐 섬유아세포 NIH3T3를 사용하여 세포 독성 분석을 하였다. 측정된 흡광도를 기반으로 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3의 각 세포에 대한 IC50를 계산하였다. HaCaT에서 20(R)-Rg3의 IC50 값은 172.4 μM, 20(S)-Rg3은 83.1 μM로나타났다. NIH3T3에서 20(R)-Rg3의 IC50 값은 341.9 μM, 20(S)-Rg3은 독성을 가지지 않아 측정할 수 없었다(Table 2).

IC50 values of 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3 for viability of HaCaT and NIH3T3 cells

Compounds IC50 (μM)
HaCaT NIH3T3
20(R)-Rg3 172.4 341.9
20(S)-Rg3 83.1 ND

Viability of HaCaT and NIH3T3 cells treated with 20(R)-Rg3 or 20(S)-Rg3. IC50 values for cell viability were obtained by MTT assay.



세포독성은 Borenfreund와 Puerner(1984)의 독성판정기준에 따라 추출액의 세포독성[고독성, IC50 <10 μM (or μg/mL); 중간독성, 10 μM (or μg/mL) ≤ IC50 <100 μM (or μg/mL); 저독성, 100 μM (or μg/mL) ≤IC50 < 200 μM (or μg/mL); 무독성, 200 μM (or μg/ mL) ≤ IC50]을 적용하였다.13)

실험결과로부터 HaCaT에서 20(R)-Rg3는 저독성, 20(S)-Rg3 중간독성으로 나타났으며, NIH3T에서는 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3 모두 무독성으로 나타났다. 따라서 20(S)-Rg3의 경우, 중간독성을 나타내기에 상처부위에 처리되었을때 각질형성세포에 20(R)-Rg3에 비해 독성이 있음을 확인하였다.

각질형성세포의 경우, 상처치유과정의 두 번째 단계인 염증단계에서 깨끗해진 상처부위로 이동한 후 증식을 하게 되는데 본 실험의 최저 농도인 12.5 μM보다 낮은 농도인 10 μM의 20(R)-Rg3가 처리되었을 때, 21.7%의 증식증가율이 보인다고 제시된 바있다.14)

20(R)-Rg3에 의한 HaCaT의 이동성과 침윤성 증가

각질형성세포가 상처부위로 이동(Migration)할 때, 20(R)-Rg3, 20(S)-Rg3가 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포 이동성 분석과 침윤(Invasion)을 확인하기 위한 세포 침윤성 분석을 진행하였다. 세포 독성 분석에서 확인한 농도를 기준으로 28, 14, 7, 3.5 μM의 20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3를 실험군으로 설정하였고 DMSO 대조군과 비교하였다.

Migration assay 결과, 20(R)-Rg3의 농도가 증가할수록 HaCaT 의 이동성이 증가하였다. 반면, 20(S)-Rg3의 농도가 증가할수록 이동성이 감소하였다. 20(S)-Rg3의 경우, HaCaT에 중간독성을 나타내며 농도가 증가할수록 독성이 강해지기 때문에 이동 가능한 세포 수가 감소되는 것이라고 생각하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Mobility and invasiveness of HaCaT cells treated with 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3. (A) Quantitative analysis of migration assays in HaCaT cells treated with non-toxic concentrations (28, 14, 7, and 3.5 μM) of 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3. Mobility of cells treated with 20(R)-Rg3 increased in a concentration-dependent manner. On the other hand, mobility of cells treated with 20(S)-Rg3 decreased in a concentrationdependent manner. (B) Quantitative analysis of invasion assays in HaCaT cells treated non-toxic concentrations (28, 14, 7, and 3.5 μM) of 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3. Invasiveness of cells treated with 28 μM 20(R)-Rg3 was higher than in control cells. Invasiveness of cells treated with 20(S)-Rg3 decreased in a concentration-dependent manner. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001 vs. DMSO (control).

Invasion assay 결과, 20(R)-Rg3는 28 μM에서 침윤성이 대조군에 비해 16%의 증가를 보였다. 20(S)-Rg3는 농도가 증가할수록 침윤성이 감소하였는데, 이 또한 독성의 영향이라고 생각하였다.

상처치유과정 중 증식단계에서 각질형성세포의 이동과 증식이 20(R)-Rg3에 의해 증가됨을 확인하였다. 또한 20(S)-Rg3는 Rg3의 광학 이성질체지만, 20(R)-Rg3에 비해 독성을 가지고 상처치유에 역효과를 가지고 있다. 따라서 20(R)-Rg3를 이용한 단일 광학 이성질체 의약품의 개발이 바람직하다. 이때, 20(R)-Rg3 가 각질형성세포의 이동과 증식을 증가시킨다는 점에서 피부암 등에 미칠 부작용이 고려될 필요가 있다.

20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3에 의한 NIH3T3의 이동성

상처치유과정 중 증식단계에서 섬유아세포의 이동과 증식도 이후 상처 치유에 중요한 과정이다. 따라서 쥐의 섬유아세포인 NIH3T3을 이용한 세포 이동성 분석을 하였다. HaCaT의 분석과 동일하게 실험군과 대조군을 설정하였다.

Migration assay 결과, 20(R)-Rg3에서는 농도에 따른 변화는 없었지만, 대조군에 비해 20% 정도 감소하였다. 하지만 이 실험 결과는 p-Value 값 계산 결과 통계적 유의성이 없다고 판단하였다. 20(S)-Rg3에서는 농도가 증가할수록 NIH3T3의 이동성이 감소하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Mobility of NIH3T3 cells treated with 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3. Quantitative analysis of migration assays in NIH3T3 cells treated with non-toxic concentrations (28, 14, 7, and 3.5 μM) of 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3. Migration of cells treated with 20(R)-Rg3 did not change with drug concentration. Migration of cells treated with 20(S)-Rg3 decreased in a concentration-dependent manner. NSp>0.05, **p≤0.01 vs. DMSO (control).

상처치유과정 중 증식단계에서 20(R)-Rg3에 의한 섬유아세포의 이동성에 대한 경향성을 확인할 수 없었지만 각질형성세포에서 20(R)-Rg3의 이동성과 침윤성 증대의 확실한 실험 결과가 있었기 때문에 20(R)-Rg3가 상처 치유에 도움이 되는 의약품의 개발에 도움이 될 것이라고 생각된다.

20(R)-Rg3에 의한 COL1A2, ACTC1 유전자 발현 증가

20(R)-Rg3와 20(S)-Rg3가 HaCaT에 가지는 영향으로 인한 상처치유 작용기전을 확인하기 위하여 연관된 유전자들을 스크리닝 하였다. 실험 결과로써 20(R)-Rg3를 처리했을 때, COL1A2, ACTC1 유전자가 DMSO를 처리한 대조군에 비해 발현이 증가되었고, 그에 반해 20(S)-Rg3를 처리하였을 때는 DMSO를 처리한 대조군에 비해 발현이 감소되었다(Fig. 4).

Fig. 4. 20(R)-Rg3 increases the level of type 1 collagen, a structural protein of extracellular matrix (ECM), and expression of genes involved in wound healing. mRNA levels of genes related to wound healing in HaCaT cells treated with 20(R)-Rg3 or 20(S)-Rg3 28 uM concentrations. In HaCaT cells treated with 20(R)-Rg3, expression of COL1A2 and ACTC1 genes was higher than in control cells treated with DMSO. On the other hand, HaCaT cells treated with 20(S)-Rg3 expressed lower levels of COL1A2 and ACTC1 than in the DMSO-treated control group. NSp>0.05, *p≤0.05 vs. DMSO (control).

COL1A2는 콜라겐 유형 I의 구성성분인 α2체인 단백질을 암 호화 하는 유전자로 알려져 있다(Table1). 이전의 다른 연구에서 Ginsenoside 혼합물에 의해 프로 콜라겐 유형 I의 합성이 유도되고, COL1A2 프로모터의 활성화를 통해 콜라겐 생성을 촉진했다.15) 우리의 연구 결과는 Ginsenoside 혼합물 중에서도 단일 성분인 20(R)-Rg3가 COL1A2의 유전자 발현을 증가시켰는데 20(R)-Rg3에 의한 COL1A2 유전자 활성화는 콜라겐 유형 I의 ECM 축적을 촉진시켜 창상의 재상피화 과정에 도움을 줄 것이다.16)

20(R)-Rg3에 의해 발현이 증가한 ACTC1 유전자는 액틴에 대한 단일 필수 유전자를 암호화 하는 유전자로 알려져 있다(Table 1). 세포 모양 변경 및 재배열이 필요한 다른 생물학적 과정과 마찬가지로 상처치유 과정에서 액틴으로 구성된 미세소관과 미세섬유는 새로운 막 구성 요소 및 세포들을 상처 부위로 이동시키는 역할을 한다.17) ACTC1 유전자의 발현 증가는 상처치유에 동원되는 액틴 단백질의 활성화로 상처 부위로의 호중구, 대 식세포, 각질세포, 섬유아세포 및 새로운 막을 구성하는 막 단백질의 운반을 증가시켜 상처치유에 긍정적인 영향을 줄 것이라고 생각된다.

In-vivo 상처 치유 분석

상처유발 후 15일까지 상처면적 변화를 육안으로 관찰하였다. 상처유발 초기에는 상처 부위에서 혈액과 삼출물이 분비되고, 염증성 변화가 나타났으나시간이 경과함에 따라 상처 부위 조직의 수축과 상피화가 진행되면서 미상피 육아 조직이 점차 감소되어 상처면적이 줄어들고 마지막 15일에는 반흔 형성이 일어났다.

DMSO와 20(R)-Rg3, DMSO와 20(S)-Rg3를 처리한 마우스에서 상처유발 후 초기면적에 대한 상대적 면적 크기를 비교하였다. 상처 유발 7일 경과 후에 20(R)-Rg3를 처리한 마우스는 DMSO를 처리한 대조군에 비해 상처면적이 더 크게 감소하였고 그에 반해 20(S)-Rg3를 처리한 마우스는 DMSO를 처리한 대조군과 비교하였을 때 초기면적에 대한 상대면적의 크기 감소가 큰 차이가 없었다. 상처 유발 15일 경과 후에는 20(R)-Rg3, 20(S)-Rg3를 처리한 마우스 모두 다 DMSO를 처리한 대조군과 초기면적에 대한 상대면적 크기가 비슷한 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

Fig. 5. 20(R)-Rg3 improves wound closure in the early stages of wound healing, whereas 20(S)-Rg3 has no effect. (A) Representative photographs of wounds on the skin of BALB/c mice treated with 20(R)-Rg3 and 20(S)-Rg3 diluted in PBS at a 100 μM concentrations, showing the macroscopic wound closures on days 0, 7, and 15 after injury, compared with control mice treated with DMSO. (B) Ratios of wound areas on day 7 and day 15 vs. the initial area on day 0 after treatment with DMSO (control), 20(R)-Rg3, or 20(S)-Rg3 treatment. Seven days after surgery, mice treated with 20(R)-Rg3 had lower wound area ratios than mice treated with DMSO. By contrast, mice treated with 20(S)-Rg3 exhibited no difference in wound area ratio relative to the control group. NSp>0.05, *p≤0.05 vs. DMSO (control).

결과적으로 20(R)-Rg3가 초기 단계에서 상처 치유 속도를 증가시켰고, 20(S)-Rg3의 경우, 대조군에 비해 속도에 영향을 주지 못하였다. 비록 상처가 최종적으로 완치되는 시점이 동일하여 상처의 전체 치료 기간이 같다고 하더라도, 20(R)-Rg3에 의한 상처치유 초기 속도의 증가는 초기에 상처 면적을 신속하게 수축함으로써 이차 감염에 대한 가능성을 감소시켜주는 효과를 나타낼 수 있을 것이다.

결 론(Conclusion)

본 연구에서는 20(R)-Rg3의 상처치유 약리활성에 대해서 검증하였다. 각질형성세포를 이용한 세포 독성, 이동성, 침윤성 분석을 통하여 20(R)-Rg3가 저독성을 가지며 이동성과 침윤성을 증가시키는 것을 확인하였다. 20(S)-Rg3는 각질형성세포에 중간독성을 가지며 이동성과 침윤성을 감소시키기 때문에 광학 이성질체를 분리하여 20(R)-Rg3만을 사용하게 되면 Rg3를 사용하는 것보다 상처치유효과에 좀 더 긍정적일 것으로 예상된다. NIH3T3를 이용한 이동성 실험에서는 20(R)-Rg3의 유의미한 유효성를 검증하지 못하였지만, 인간의 섬유아세포에 Rg3를 처리하여 세포외기질의 분해감소와 합성증가를 검증한 논문 결과를 보아 상처치유과정 중 재형성단계에 도움이 될 것으로 예상한다.18) 또한 in-vivo 동물 상처 분석을 통하여 20(R)-Rg3가 상처치유 과정의 염증, 증식 단계의 속도를 증가시킴을 검증하였다. 따라서 이러한 20(R)-Rg3의 활성에 대한 검증은 각질형성세포의 상처 치유의 가능성을 제공할 것으로 사료된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 연구는 충남대학교 학술연구사업에 의해 지원되었으며, 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

References
  1. Kwon MJ, Park JH (2009) Impaired wound healing in diabetes mellitus. Korean Diabetes J 33: 83-90.
    CrossRef
  2. Velnar T, Bailey T, Smrkolj V (2009) The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms. J Int Med Res 37: 1528-1542.
    Pubmed CrossRef
  3. Nam KY (2002) Clinical applications and efficacy of Korean Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). J Ginseng Res 26: 111-131.
    CrossRef
  4. Park MW, Ha J, Chung SH (2008) 20 (S)-ginsenoside Rg3 enhances glucose-stimulated insulin secretion and activates AMPK. Biol Pharm Bull 31: 748-751.
    Pubmed CrossRef
  5. Yun TK, Lee YS, Lee YH, Kim SI, Yun HY (2001) Anticarcinogenic effect of Panax ginseng CA Meyer and identification of active compounds. J Korean Med Sci 16: S6-S18.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  6. Shibata S (2001) Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds. J Korean Med Sci 16: S28-S37.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  7. Lee HU, Bae EA, Han MJ, Kim DH (2005) Hepatoprotective effect of 20(S)-ginsenosides Rg3 and its metabolite 20(S)- ginsenoside Rh2 on tert-butyl hydroperoxide-induced liver injury. Biol Pharm Bull 28: 1992-1994.
    Pubmed CrossRef
  8. Kim KJ. Choi I. Seo KH, Han HK, Lee WJ (2011) Regulatory requirements on the safety and efficacy evaluation for the development of stereoisomeric drugs. Yakhak Hoeji 55: 426-431.
  9. Zhou R, Yang Y, Park SY, Nguyen TT, Seo YW, Lee KH, Lee JH, Kim, H (2017) The lichen secondary metabolite atranorin suppresses lung cancer cell motility and tumorigenesis. Sci Rep 7: 8136.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Yang Y, Nguyen TT, Jeong MH, Crisan F, Yu YH, Ha HH, Choi KH, Jeong HG, Jeong TC, Lee KY, Kim KK, Hur JS, Kim H (2016) Inhibitory activity of (+)-usnic acid against non-small cell lung cancer cell motility. PloS One 11: e0146575.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  11. Zhang Q, Liu W, Cai Y, Lan AF, Bian Y (2018) Validation of internal control genes for quantitative real-time PCR gene expression analysis in Morchella. Molecules 23: 2331.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  12. Körkkö J, Ala-Kokko L, Paepe AD, Nuytinck L, Earley J, Prockop DJ (1998) Analysis of the COL1A1 and COL1A2 genes by PCR amplification and scanning by conformation-sensitive gel electrophoresis identifies only COL1A1 mutations in 15 patients with osteogenesis imperfecta type I: identification of common sequences of null-allele mutations. Am J Hum Genet 62: 98-110.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  13. Borenfreund E, Puerner J (1985) A simple quantitative procedure using monolayer cultures for cytotoxicity assays (HTD/NR-90). J Tiss Cult Meth 9: 7-9.
    CrossRef
  14. Park S, Ko E, Lee JH, Song Y, Cui CH, Hou J, Jeon B, Kim HS, Kim SC (2019) Gypenoside LXXV promotes cutaneous wound healing in vivo by enhancing connective tissue growth factor levels via the glucocorticoid receptor pathway. Molecules 24: 1595.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  15. Lee J, Jung E, Lee J, Huh S, Kim J, Park M, So J, Ham Y, Jung K, Hyun CG, Kim YS, Park D (2007) Panax ginseng induces human Type I collagen synthesis through activation of Smad signaling. J Ethnopharmacol 109: 29-34.
    Pubmed CrossRef
  16. Papaioannou I, Xu S, Denton CP, Abraham DJ, Ponticos M (2018) STAT3 controls COL1A2 enhancer activation cooperatively with JunB, regulates type I collagen synthesis posttranscriptionally, and is essential for lung myofibroblast differentiation. Mol Biol Cell 29: 84-95.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  17. Abreu-Blanco MT, Watts J, Verboon JM, Parkhurst SM (2012) Cytoskeleton responses in wound repair. Cell Mol Life Sci 69: 2469-2483.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  18. Kim SW, Jeong JH, Jo BK (2004) Anti-wrinkle effect by Ginsenoside Rg3 derived from Ginseng. J Soc Cosmet Scientists Korea 30: 221-225.


June 2021, 65 (3)
Full Text(PDF) Free

Social Network Service
Services

Cited By Articles
  • CrossRef (0)

Funding Information