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Rapid and Sensitive Quantification Method of Sphingosine and Sphingosine-1-phosphate in Human Serum by Ultra High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)
Yakhak Hoeji 2021;65(1):31-40
Published online February 28, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Seonghoon Na and Hye-Ran Yoon#

College of Pharmacy, Duksung Women’s University
Correspondence to: Hye-Ran Yoon, College of Pharmacy, Duksung Women’s University, Samyangro-144 gil 33, Dobong-gu, Seoul 01369, South Korea
Tel: +82-2-901-8387, Fax: +82-2-901-8386
E-mail: hyeran11@duksung.ac.kr
Received January 13, 2021; Revised February 2, 2021; Accepted February 8, 2021.
Abstract
Sphingosine (SPH) and sphingosine-1-phosphate (S1P) are emerging as key players in asthma metabolism and in numerous cellular inflammation processes. To identify potential biomarkers of asthma and inflammatory therapeutics, it is essential to determine their levels. Herein, we developed a rapid and sensitive UHPLC-MS/MS method to simultaneously quantify SPH and S1P in human serum using C17-SPH and C17-S1P as internal standards. After methanol precipitation of serum proteins, the supernatants were analyzed by MS/MS performed in the positive ion mode by multiple reaction monitoring. UHPLC analysis (C18 column) was performed using two mobile phase systems (water containing 0.1% formic acid, and 85% acetonitrile containing 0.1% formic acid) within 5 min of the short run. The calibration curves were linear in the range of 0.002-1.5 μg/mL for S1P and SPH with an R2 greater than 0.9999. The LOD and LOQ were 0.0002 and 0.0004 μg/mL for S1P, and 0.0005 and 0.001 μg/mL for SPH, respectively. The accuracy and precision of the method were in the range of 89.8-100.7% (RSD, 1.5-2.8%) for both SPH and S1P species. We were able to quantify both molecules in serum from healthy and asthmatic patients. These results suggest that SPH and S1P are promising potential biomarkers, and also contribute to the basic data for the construction of an omics-based platform for preventive index prior to asthma diagnosis.
Keywords : asthma, serum, sphingolipids, sphingosine, sphingosine-1-phosphate, UHPLC-MS/MS
서론(Introduction)

스핑고 지질인 스핑고신(sphingosine, 이하 SPH)이나 라이소스핑고 지질(lysosphingolipid)인 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, 이하 S1P) 및 관련 화합물은 사람의 정상 혈장과혈청의 구성 요소이다. 이 물질들은 세포와 혈관에서의 면역체계에 영향을 주는 중요한 생체활성 지질 매개체(bioactive lipid mediator)이며 신호전달 분자(signaling molecule)이다. S1P는 세포 내의 2차 신호전달자(2nd messenger)로서 SPH kinase에 의해SPH으로부터 합성되며 세포의 성장, 사멸, 분화, 이동과 같은 생물학적 반응을 조절한다. 하지만 혈장막 수용체(plasma membrane receptor)의 식별을 통하여 S1P의 기능이 재평가되면서 세포내신호전달자 역할 외에도 세포외 매개체의 역할도 하는 것으로밝혀졌다.1-6)

S1P는 혈소판에서 많이 발현되는데 이것은 혈소판(platelet)에서의 SPH kinase의 높은 활성과 S1Plyase의 결핍 상태에서 활성화된 혈소판에서 유리되기 때문이다.2-3) 정상인의 혈장 및 혈청 중 S1P의 농도범위는 약 200-1,000 nmol/L4-5)이며, 혈장 중농도가 혈청에서의 농도보다 낮다. 혈장과 혈청 중의 S1P는 특히 고밀도 지단백질(HDL) 분획에 축적된다.5)

천식, 당뇨, 비만과 같은 질환은 대사과정의 불완전한 영향으로 면역 체계가 교란되면서 장내 세균의 조성과 기능적인 변화를 통해 효소 활성이 저하됨으로서 스핑고 지질이나 담즙산 등의 혈청 프로파일이 정상인과는 달라지는 경향을 보이는 것으로 보고되었다.6) 전 세계적으로 대사질환의 유병률이 증가함에따라 대사질환의 컨트롤의 중요성이 커지고 있으며, 이에 따라스핑고 지질이나 담즙산의 수용체를 통한 대사과정에서의 조절 작용이 대사질환 치료에 있어서 중요한 표적물질로 주목받고 있다.2.3) 따라서 천식 및 염증 치료제에 대한 표적 바이오 마커를개발하거나 세포내 SPH와 S1P의 조절 기능을 과학적으로 증명하기 위하여 이 물질을 동시에 정량하는 방법을 개발하는 것은필수적이라 할 수 있다.

2011년 이전에는 혈장 중의 SPH나 S1P를 측정하기 위해서는 위해성이 있는 방사성 동위원소를 사용하였다.7) 기존의 방법에 대한대안으로 HPLC를 사용하였으나 이 기기도 전처리 과정의 복잡성외에도 장시간의 시료처리에 따른 불편함이 존재하였으며 복잡한유도체화 방법 등을 사용하므로 여전히 문제점이 존재하였다.8-14)

최근에는 “shotgun 지질체학(lipidomics)” 기법을 이용하여 스핑고지질을 분석한 방법이 보고되었다. 이 보고에서는 샘플을질량 분석기로 직접 주입하므로,15-19) 더 간단하고 감도가 우수하다는 장점이 있으나 크로마토그래피를 이용한 분리가 없는 과정이므로 동중원소의 간섭(isobaric interference)이나 매트릭스 효과를 최소화하기 위해 다단계 추출과정이 필요하며 노동 집약적이고 시간 소모가 많다는 단점이 있다. 이 후 HPLC 방법보다 진보된 전자분무 이온화(electrospray ionization, 이하 ESI)를사용한 LC-MS/MS 분석 및 다중이온모니터링 (MRM)20-27) 모드를 이용한 SPH 및 S1P의 정량법이 보고되었다. 하지만 이 보고들도 과정이 복잡한 화학적 유도체화를22) 이용하거나 전처리과정에서 시간 소모가 많거나20) [13C2D2] S1P와 같은 방사성 표지물질을 내부표준물질로 사용하므로 쉽게 접근하기 어려웠다.21)

본 연구에서는 다양한 추출법, 방사성 표지물질 사용 및 유도체화과정 없이 이전의 논문 보고에서의 단점을 극복하면서도 1)메탄올을 이용한 1단계 전처리법과 2) 고가의 칼럼이 아닌 기존의 C18 칼럼을 사용하면서 최적의 이동상을 선정하였고, 3)기존의 방법을 변형한 최적의 UHPLC-MS/MS 조건을 확립하였으며, 4) 국내에서는 최초로 건강한 사람과 천식환자의 혈청으로부터 SPH 및 S1P를 정량하여 이에 보고하고자 한다.

방법(Methods)

시약 및 기기

SPH 표준품은 TCI사(Tokyo, Japan)로부터 그리고 S1P 표준품은 AVANTI사(MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 내부 표준액으로 C17-sphingosine (이하 C17-SPH)과 C17-sphingosine-1-phosphate (이하 C17-S1P)를 AVANTI 사(MA, USA)에서 공급받았다(Fig. 1). 용매 및 이동상으로 사용된 아세토니트릴과 암모니움 아세테이트는 HPLC급 및 잔류농약 분석용 시약을 사용하였으며 각각 J.T. Baker사(NJ, USA) 및 Samchun사(Pyeongtaek, South Korea)에서 구입하였다. 혈청의 제단백 과정에서 사용된메탄올은 HPLC급으로 J.T. Baker 사(NJ, USA)에서 구입하였다.초순수 증류수는 Duksan Chemicals사(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 제단백 및 여과에 사용된 centrifuge tube filter는 Corning (NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 30% Bovine serum albumin은 Sigma사(MA, USA)로부터 구입하였고 희석하여 2%를surrogate matrix로 사용하였다. 텐덤질량분석기의 가스인 초고순도 압축 액체 질소(liquid nitrogen)는 유진가스 사(Seoul, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.

Fig. 1. Molecular structure and empirical formula for SPH, S1P, C17-SPH and C17-S1P.

Ultra high-performance liquid chromatography

초고성능 액체크로마토그래피(ultra high-performance liquid chromatography, 이하 UHPLC) 및 펌프는 Shimadzu사의 Nexera X2 LC-30AD 모델과 함께 SIL-30AC autosampler를 사용하였다. 칼럼은 Imtakt사(Kyoto, Japan)의 Cadenza CD-C18 칼럼(metal free, 150 mm×2.0 mm I.D., 3 µm particle size)을 사용하였으며, 칼럼온도는 40°C로 유지하였고, 칼럼 유속은 0.3 mL/min 이었다.

혈청 시료 중 SPH와 S1P의 분석을 위한 UHPLC의 조건은다음과 같다. 이동상 A는 0.1% formic acid를 포함한 물을 사용했고, 이동상 B는 0.1% formic acid를 포함한 85% 아세토니트릴을 사용하였다. 농도구배 용리를 위하여 이동상 B를 70% 에서 95% 까지 변화시키는 조건을 사용하였다.

UHPLC-ESI-MS/MS 분석조건

전자분무이온화 텐덤질량분석기(electrospray tandem mass spectrometry, 이하 ESI-MS/MS)는 Shimadzu사(Kyoto, JApan)의 MS/MS 8040 triple quadrupole 모델을 사용하였으며, ESI-MS/MS의조건은 다음과 같다.

초고순도 질소를 충돌 가스로 사용하였다. 양이온 획득 모드를 사용하였고, MRM (multiple reacation monitoring) 모드상에서정량을 위해 선택한 두 이온 중 하나는 모이온이었고, 또 다른이온은 딸이온 중 구조를 특징지을 수 있으며 스펙트럼의 강도가 큰 것을 선택하였고 얻어진 모든 데이터는 Lab solution 프로그램(Shimadzu, Japan)을 이용하여 분석하였다.

SPH와 S1P의 분석을 위한 최적의 MS/MS 기기 조건은 interface voltage; 4.5 kV, nebulizer gas (N2) flow; 1.5 L/min, drying gas flow; 15 L/min, dissolution line temperature; 250°C, heatblock temperature (N2); 400°C, collision-induced dissociation gas (argon gas); 230 Kpa, detector voltage; −2.04 kV이었으며 각 분석물질의 선택이온과 머무름시간, MRM transition, collision energy (CE)는 Table 1에 나타내었다.

MS parameter for sphingolipids studied

Analytes Molecular mass RT(min) MRM transition CE (V)
S1P Sphingosine-1-phosphate 379.2 2.817 380.20 > 264.20 -15.0
SPH Sphingosine 299.2 4.626 300.20 > 282.25 -11.0
Internal standards IS MRM transition
C17-S1P C17-SPH-1-phosphate 365.2 2.098 366.10 > 250.15 -15.0
C17-SPH C17-SPH 285.3 3.612 286.30 > 268.20 -11.0



혈청 검체

본 연구에 사용된 통합 혈청은 25명의 건강한 사람의 정상 혈청으로부터 조제되었다. 6명의 정상 혈청과 5명의 천식 환자 혈청이 별도의 임상 시료 적용을 위하여 개별적인 혈청으로 준비되었다. 모든 혈청 검체는 한양대학교 의과대학에서 IRB 승인(IRB No., HYI-18-227-1)을 받은 후 제공 받았으며 폴리에틸렌튜브 내의 혈청검체는 받은 즉시 −20ºC에서 보관하였고, 분석직전 녹여서 사용하였다.

혈청 중 SPH와 S1P의 정량

표준용액 제조-Stock standard solution의 조제(1 mg/mL)는 상온 보관하였던 SPH와 S1P의 표준품을 각각 메탄올과 dimethyl sulfoxide (이하 DMSO)에 녹여 조제한 후 냉장 보관하였다. Working standard solution의 제조는 stock solution (1 mg/mL)을메탄올로 희석하여 7가지의 다른 농도로 조제하였다. SPH는0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 1, 5, 및 10 µg/mL의 농도로 희석하여 조제하였고, S1P은 0.04, 0.1, 0.2, 0.4, 2, 10, 및 15 µg/mL로 희석하여 조제하여 사용하였다.

Stock internal standard solution은 냉장 보관된 내부표준물질(C17-SPH와 C17-S1P)을 각각 메탄올과 DMSO에 녹여 농도를1mg/mL로 조제하였고, working internal standard 용액은 stock internal standard solution을 메탄올로 희석하여 농도를 1µg/mL로 조제하여 사용하였다.

검량선 작성-검량선용 표준액은 메탄올로 희석하여 최종용액100 µL 중 SPH의 농도가 각각 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.1, 0.5, 1 µg/mL의 농도가 되도록 조제하였고, S1P은 메탄올로 희석하여 최종농도가 각각 0.004, 0.01, 0.02, 0.04, 0.2, 1, 1.5 µg/mL의 농도가 되도록 조제하였다.

7가지 서로 다른 농도로 조제된 SPH와 S1P의 표준용액 10 µL를 centrifuge filter tube에 넣고, bovine serum albumin 10 µL를 가하고, 내부표준물질인 C17-SPH와 C17-S1P의 혼액 (1 µg/mL)을 10 µL를 가하고 메탄올 70 µL를 가하여 최종부피를100 µL로 하였다. Centrifuge filter tube 내의 모든 혼액을 vortex mix로 20초 동안 잘 섞은 후 원심분리 및 여과하였다(8,000 rpm, 1분). 이 여과액을 insert가 들어간 autosampler 용 유리 바이알에옮겨 이 중 1µL를 주입하여 UHPLC-ESI-MS/MS로 분석하였다.여기서 얻은 내부표준물질의 농도에 대한 SPH와 S1P의 농도의비를 x축으로 놓고, 내부표준물질의 피크 면적에 대한 SPH와S1P의 피크 면적의 비를 y축으로 하여 검량선을 작성하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Calibration curves for S1P and SPH using UHPLC-MS/MS analysis.

밸리데이션-US Food and Drug Administration (FDA) 밸리데이션 지침서를 따라서 검증하였다. 시그날(S)과 노이즈(N)를 이용하여 분석물질의 검출한계는 S/N비가 3이 되는 농도에서 결정하였고, 분석물질의 검량한계는 S/N비가 10이 되는 농도에서 결정하였다.

일내 분석(intra-day assay) 및 일간 분석(inter-day assay)은 2%bovine serum albumin에 표준용액을 첨가하여 농도를 계산하였고, 이에 대한 정확도(accuracy)는 S1P와 SPH에 대하여 저농도 (0.01, 0.005 µg/mL), 중농도 (0.04, 0.02 µg/mL), 고농도(1.0, 0.5 µg/mL)에서 각각 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

[measured concentration]/[apparent concentration]×100%

정밀도(precision)는 변동계수(relative standard deviation, RSD%) 로서 표현하였다.

혈청 시료 분석-혈청 시료 분석을 위하여 eppendorf tube (1.5 mL 크기)에 혈청 10 µL, 내부표준액 10 µL 및 메탄올 30 µL를가한 후 20초간 vortex mix를 하였다. 50 µL의 혼액을 최종부피로 하여 centrifuge filter tube로 옮겨 원심분리 및 여과하였다(8,000 rpm, 1분). 이 여과액을 insert가 들어간 autosampler용 유리바이알에 옮겨 UHPLC-ESI-MS/MS로 분석하였다.

결과(Results)

본 연구에서는 SPH와 S1P을 ESI-MS/MS의 양이온을 얻는MRM 모드를 사용하여 동시 분석하는 신속하고 저렴하며 감도높은 정량법을 개발하였다. SPH와 S1P을 스캔하여 전체 스펙트럼을 얻은 후 선정한 MRM 이온들은 Table 1과 같이 특징적인이온을 선정하였다. S1P를 위한 MRM transition은 m/z 380.20 →m/z 264.20, 그리고 SPH를 위한 MRM transition은 m/z 300.20→m/z 282.25를 적용하여 MRM 모드를 이용하여 분석불질을 정량하였다(Table 1).

최적 분석조건 확립과 밸리데이션

3가지 다른 종류의 이동상 A, 이동상 B를 사용하여 기존의보고된 논문에 기초하여 각기 다른 이동상에 대한 크로마토그램을 얻었다(Fig. 3).

Fig. 3. Representative UHPLC-MS/MS chromatogram of S1P and SPH on 3 different mobile phase. (A) A; water containing 0.1% formic acid, B; 85% acetonitrile containing 0.1% formic acid, (B) A; water containing 0.2% formic acid, B; 85% acetonitrile containing 0.2% formic acid, (C) A; water containing 5 mM ammonium formate, B; 100% acetonitrile containing 0.1% formic acid

이동상의 영향을 확인하는 파라미터로서 α, k', S/N와 tailing factor를 조사하였다(Table 2). 첫 번째 이동상의 경우 α, k', S/N와 tailing factor가 매우 우수한 결과를 보였으며, Fig. 2의 3가지 다른 이동상 중 Fig. 3의 A번 이동상은 Table 2의 파라미터에서의 우수성을 보여줌과 동시에 외에도 크로마토그램 상에서대칭인 피크이면서 꼬리끌기가 없는 가장 우수한 이동상임을 확인할 수 있었다(Fig. 3). Fig. 4에서는 앞에서 선정한 최적의 이동상 A, B (이동상 A; 0.1% formic acid 포함한 물, 이동상 B; 0.1% formic acid 포함한 85% 아세토니트릴)를 용리하면서 서로다른 회사에서 나오는 C18 칼럼의 감도와 크로마토그램을 비교 하여 보았다. 이 중 Imtakt 사의 Cadenza CD-C18 칼럼이 표준품과 내부표준품 간의 피크 중첩이 없이 4종의 분석대상 피크모두를 잘 분리함을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Effect of mobile phase for the optimum condition of S1P and SPH separation

Mobile phase α S1P SPH

k' S/N tailing factor k' S/N tailing factor
A; 0.1% formic acid in 100% water
B; 0.1% formic acid in 85% acetonitrile
2.7 1.34 720.7 1.3 3.67 287.0 1.2

A; 0.2% formic acid in 100% water
B; 0.2% formic acid in 85% acetonitrile
2.6 0.7 779.4 1.3 1.8 71.4 1.7

A; 5mM ammonium formate in 100% water
B; 0.1% formic acid in 100% acetonitrile
2.6 0.5 533.8 2.0 1.2 53.5 1.3



Fig. 4. Comparison of UHPLC-MS/MS chromatogram for S1P and SPH on 4 different columns. (A) Imtakt cadenza C18 metal free (150×2 mm, 3 μm thickness), (B) Waters acquity C18 (150×2.1 mm, 1.8 μm thickness), (C) Imtakt unison C8 (75×2 mm, 3 μm thickness), and (D)Waters symmetry C18 (150×2.1 mm, 5 μm thickness)

최적 조건의 이동상과 가장 적합한 칼럼을 선정하여 최적 분석조건을 확립한 후 본 연구의 분석방법을 적용하였을 때 SPH는 0.0004-10 µg/mL 농도 범위에서 S1P는 0.0002-10 µg/mL 농도 범위에서 직선성을 보였으며, 이에 대한 결정계수가 SPH (R2=0.9999)와 S1P (R2=0.9999) 모두에서 매우 뛰어난 직선성을 보여주었다(Table 3, Fig. 2).

Linear range, calibration equation, limit of detection and limit of quantification for S1P and SPH

Analytes Calibration range (µg/mL) Calibration equation R2 LOQ (µg/mL) LOD (µg/mL)
S1P 0.004 - 1.5 Y = 0.6242X - 0.0020 0.9999 0.0004 0.0002
SPH 0.002 - 1 Y = 0.7668X - 0.0076 0.9999 0.001 0.0005

α; separation factor, k'; capacity factor.



사람이나 쥐의 혈청에서 SPH와 S1P을 정량 분석한 타 논문들의 정량한계 및 검출한계 농도의 결과를 본 연구의 결과와 비교하였다(Table 4). UHPLC-ESI-MS/MS의 최적 분석조건 확립후 계산된 LOD, LOQ (Table 3)는 보고된 감도와 비슷하거나 좀더 높은 감도로 SPH와 S1P을 정량 분석하는 것이 가능함을 보여주었다(Table 4).

Comparison of quantification parameters to our study

References Sample matrix Sample preparation LOD (SPH, S1P) LOQ (SPH, S1P)
Our study Human serum PPTb 0.0005, 0.0002 0.001, 0.0004
200623) Human plasma PPTb a 0.005, 0.01
201124) Human plasma PPTb a 0.001, 0.0001
202025) Human serum PPTb a, (data for S1P only) 0.025 (data for S1P only)

anot specified and bprotein precipitation



분석법의 밸리데이션을 위하여 일내(n=6) 및 일간(n=7) 정확도와 정밀도를 얻기 위하여 저농도, 중간농도 그리고 고농도의3가지 다른 농도의 표준품을 희석한 혈청 검체에 첨가하여 정밀도와 정확도를 계산하였다. SPH의 경우 일내 정확도는94.5~100.7%이며, 일내 정밀도는 2.1~2.6% 이내였다. S1P의 경우 일내 정확도는 89.8~99.4% 일간 정밀도는 1.5-2.8%으로 두화합물 모두 매우 양호한 정확도와 정밀도의 결과를 보였다.

SPH의 경우 일간 정확도는 95.4~99.7%이며, 일간 정밀도는1.7~2.9% 이내였다. S1P의 경우 일간 정확도는 97.1~101.7% 일간 정밀도는 2.0%으로 두 화합물 모두 매우 양호한 정확도와정밀도의 결과를 보였다(Table 5, 6).

Accuracy and precision for the intra-day assay

Analytes Nominal Concentrationa Concentration detecteda Accuracy ± precision (%)
SPH 0.005 0.0049 97.5 ± 2.1
0.02 0.019 94.5 ± 2.6
0.5 0.50 100.7 ± 2.1

S1P 0.01 0.0094 94.3 ± 2.8
0.04 0.036 89.8 ± 1.9
1.0 0.99 99.4 ± 1.5

aexpressed in μg/mL (n=6)



Accuracy and precision for the inter-day assay

Analytes Nominal Concentrationa Concentration detecteda Accuracy ± precision (%)
SPH 0.005 0.005 99.7 ± 1.7
0.02 0.019 95.4 ± 2.5
0.5 0.48 96.6 ± 2.9

S1P 0.01 0.012 101.7 ± 2.0
0.04 0.39 97.1 ± 2.0
1.0 0.98 98.2 ± 2.0

aexpressed in μg/mL (n=7)



혈청 중 SPH와 S1P의 정량

2% Bovine serum albumin에 SPH와 S1P의 표준품을 첨가한후 새로운 분석방법으로 3회 반복 측정하였을 때 SPH와 S1P의피크는 5분 이내의 매우 빠른 머무름 시간을 보여주었다(Fig. 5B and 5C). 건강한 사람(Fig. 5D and 5E)과 천식환자의 혈청(Fig. 5F and 5G)을 분석하였을 때 SPH와 S1P의 피크는 대칭이면서꼬리끌기가 거의 없는 매우 양호한 total ion chromatogram (TIC)을 보여주고 있다.

Fig. 5. Total ion chromatograms (TIC) of S1P and SPH on different matrix using UHPLC-MS/MS in MRM mode. (A) blank, (B) internal standards on blank, (C) standard spiked to bovine serum albumin, (D) human healthy subject serum 1, (E) human healthy subject serum 2, (F) human serum with asthma 1 and (G) human serum with asthma 2 (a; C17-S1P, b; S1P, c; C17-SPH and d; SPH)

다중이온 모니터링 (multiple reaction monitoring, MRM)상에서의 크로마토그램을 비교해 보면 공시료(Fig. 6A), 2% Bovine serum albumin에 표준용액(S1P; 0.2 µg/mL SPH; 0.1 µg/mL)을첨가한 것(Fig. 6B), 건강한 사람의 혈청(Fig. 6C)에서 SPH와 S1P가 matrix effect28) 없이 우수한 감도의 크로마토그램을 보여주었다. 건강한 6명의 혈청과 천식환자 5명의 혈청 중 SPH와 S1P의 양을 정량하고 S1P/SPH의 비율을 계산하였다. 두 그룹은 확연하게 다른 S1P/SPH의 비율을 보였고, 본 결과를 제한된 천식환자가 아닌 대규모의 집단에 적용시킬 수 있다면 정상인과 천식 환자를 구별할 수 있는 biomarker로서의 파라미터를 적절하게 응용할 수 있을 것이다(Table 7).

Quantification of serum S1P and SPH in healthy subjects and patients with asthma

Analytes Concentrationa

S1PSPHS1P / SPH ratio

Mean ± SD RSD(%) Mean ± SD RSD(%) Mean ± SD
Control 1 0.40 0.41 ± 0.03 6.7 0.021 0.019 ± 0.002 8.9 19.0 21.2 ± 1.5
2 0.44 0.022 20.0
3 0.42 0.019 22.1
4 0.36 0.017 21.2
5 0.40 0.019 21.1
6 0.43 0.018 23.9

Asthma 1 0.29 0.30 ± 0.03 9.6 0.057 0.058 ± 0.005 8.6 5.1 5.3 ± 0.8
2 0.30 0.060 5.0
3 0.27 0.066 4.1
4 0.30 0.051 5.9
5 0.35 0.055 6.4

aexpressed in μg/mL



Fig. 6. MRM chromatograms of S1P and SPH on different matrix using UHPLC-MS/MS. (A) internal standards in blank, (B) standard spiked to bovine serum albumin and (C) human healthy subject serum 1 (a; C17-S1P, b; S1P, c; C17-SPH and d; SPH)

본 연구의 결과를 통하여 새로 개발한 UHPLC-MS/MS 분석법은 SPH와 S1P의 동시 분석을 위해 매우 양호한 분석법임을확인할 수 있었다(Table 7).

고찰(Discussion)

LC-ESI-MS/MS를 이용한 분석을 위하여 시행하는 시료 전처리 방법으로는 GC-MS나 LC-MS를 이용할 때와 마찬가지로 액체-액체 추출법, 고체상추출법, 숯을 사용하거나 극미량의 농도로 존재하는 물질의 경우에는 농축과 같은 전처리가 사용되었다.19-20) 혈청이나 혈장 전혈 등을 분석할 경우 지질, 인지질, 지방산 등과 같은 내인성 물질을 제단백 처리법만으로는 효과적으로 제거할 수 없는 경우가 많고, 특히 전자분무이온화 방식에서는 이러한 방해 물질은 이온의 억제 효과를 일으키는 원인이되고 있다. 다양한 물질들의 분석방해를 제거하기 위하여 기존에는 액체-액체 추출법이나 고체상추출법이 상당히 많이 사용되었다. 본 연구에서는 비용, 시간, 노동력이 많이 드는 전처리법없이 1단계만의 제단백과 여과 과정의 간편한 전처리만으로도높은 정확도와 정밀성을 가지며 SPH와 S1P의 동시 정량 분석이 가능하였고, 이는 상당히 효율적인 분석법이라고 여겨진다.

스핑고 지질은 모든 진핵 생물의 도처에서 발현되며 세포막의 구조적 구성 요소로서의 역할 외에도 스핑고 지질대사는 다양한 생물학적 기능을 조절하는 중간체들을 발현시키는 등 수십년 간 스핑고 지질 대사산물인 세라마이드(Ceramide, 이하 Cer)의 역할, SPH 및 인산화 생성물인 S1P 등 이와 관련된 수많은지식이 축적되었다. 따라서 스핑고 지질 가변저항적(rheostat) 개념은 세포 내 S1P/SPH의 비 혹은 Cer과의 비 혹은 그에 따른반대 신호 경로가 나타난다면 세포의 생존 여부를 결정하는 중요한 요소가 될 수 있다는 것이다.2) S1P1 수용체는 혈관 신생및 신경 발생과 면역 세포의 trafficking의 조절, 내피 장벽 기능및 혈관 긴장에 관여하는 주요한 역할을 담당하고 있다.1,2)

Lan et al.24)의 보고에서는 여러 스핑고 지질 대사산물, 특히 Cer, SPH 및 S1P은 세포의 성장과 세포 사멸을 조절하는 생체활성의 핵심 분자로 확인되었다. 이들 Cer와 SPH은 세포 증식과 세포 자멸사를 촉진하는 네거티브 조절제로 작용한다. 이와는 대조적으로 S1P (SPH의 인산화 생성물)는 세포 증식을 가속화시키며(stimulating) 및 세포 자멸사를 억제하는 것으로 보고하였다. 신호 전달 경로에서의 SPH/S1P의 비의 불균형은 자가 면역, 암, 혈관 신생, 혈관 투과성 및 심근 경색 등 대다수 사람들의 세포의 운명과 많은 질병의 진행과정에 기여하고 있는 것으로 밝혀지고 있다.24) 따라서 SPH와 S1P의 균형을 고려하여 SPH및 S1P의 동적 수준을 모니터링하면 사람의 생체대사물과 관련된 생물학적 기본 메커니즘을 규명할 수 있을 것으로 여겨진다. Lan et al.24)은 SPH 혹은 S1P 혹은 SPH와 S1P의 동시 분석을이용하면 질병 치료과정 중 하나로 환자의 상태를 모니터링하는 데 이용 될 수 있을 것으로 보고하였다. 그러므로 이 두 물질의 동시 분석방법의 개발은 임상 분석의 매우 중요한 일로 주목을 받고 있다.

가장 최근의 보고로는 폐암 환자의25) 방사선 요법 시, 환자의혈청 S1P 농도의 변화를 임상상태와 비교하여 폐암 환자를 모니터링 하기 위하여 LC-MS/MS 분석방법을 이용하였다. 이와 같이 S1P 스핑고지질 분석을 위한 새로운 LC-MS/MS의 분석법의 개선 등 건선, 습진, 자가면역질환, 난소암 등 질병 상태의모니터링을 위해 매우 중요한 역할을 하고 있다. 1차 담즙산의대사과정과 연관된 스핑고 지질과 라이소스핑고 지질 중 하나인 SPH와 S1P은 대사질환에서 사람의 질병과 관련된 중요한 표적 물질로서의 역할도 하고 있다.

SPH와 디하이드로스핑고신26)을 정량하여 성별과 연령을 일치시킨 대조군과 다발성 경화증으로 고통받는 사람들의 혈장에서얻은 데이터를 통해 예측해 볼 수 있는 것은 비표적 접근법이 었음에도 불구하고 다발성 경화증 환자들의 혈액에서는 SPH과디하이드로스핑고신이 더 낮은 농도로 존재함이 밝혀졌다. 이두 물질은 추후 대규모의 코허트 샘플 세트에서 검색하고 연구해 볼 만큼 혈액 내에서의 이 화합물의 농도와 질병의 지표로서의 관계를 추론해 볼 수 있는 데이터를 보여주고 있다.

Reineke et al.29)은 S1P의 농도의 수준이 증상정도에 따라 다를 수 있다고 보고하였다. 건강한 사람(22명)과 천식군(경증 12명, 중증 20명, 심각한 중증 22명)의 시료를 대상으로 혈청 중S1P의 농도를 비교하였다. 천식 질환의 정도가 경증이나 중증까지는 건강한 사람에 비해 S1P의 농도가 0.93-1.03배로 작거나비슷한 수준이었고, 심각한 중증인 경우 건강한 사람에 비해 S1P의 농도가 1.11배인 결과를 보여 주었다(p-value는 0.07). 천식 환자에게서 S1P의 농도는 증상정도에 따라서 일정한 경향성을 보이지 않았다.

본 연구에서 건강한 6명의 혈청과 천식 환자 5명의 혈청 중S1P의 농도를 정량하였을 때, 건강한 사람 대비 S1P의 평균농도가 0.73배로 작은 수준임을 확인하였고, Reineke et al.29)의 연구에서 보여준 건강한 사람 대비 경증환자의 S1P의 농도 배수와 유사한 결과를 보였다(Table 7).

시료수를 대규모로 증가시켜 본 연구를 적용하여 천식 환자의 증상정도에 따른 S1P의 농도 수준을 비교하는 후속연구가진행된다면 정상인과 천식 환자를 구별하는 것뿐만 아니라 천식 환자 그룹 내에서도 증상 수준까지 판별할 수 있는 진단 보조의 역할로 응용될 수 있을 것이다.

본 연구에서는 혈청 중 SPH와 S1P에 대한 정성·정량 분석법을 검증하였다. 추후 본 연구를 확대하여 좀 더 다양한 종류의시료 (cell cultured cell, tissue, 기관지 조직세포 등)에 광범위한생체시료에 적용함으로써 실제 임상적으로 활용 가능한 대사체기반 진단 예측 플랫폼으로 응용할 수 있도록 연구를 확장하고자 한다.

결론(Conclusion)

본 연구는 인력, 시간 및 비용을 고려하여 추출 절차 및 LC-MS/MS 특성을 최적화 구체화하였으며 밸리데이션을 통하여UHPLC-MS/MS를 이용하여 신속하고 감도 높게 혈청 중 SPH와 S1P의 동시분석 정량법을 개발하였다. 개발한 SPH와 S1P의동시분석법은 높은 감도, 정확도, 정밀도 그리고 매우 우수한 정량 한계를 보였으며, 실제 임상 시료인 혈청에 적용이 가능함을확인하여 추후 다양한 질환모델의 대사체학이나 질병예측 진단플랫폼으로 응용 가능할 것으로 여겨진다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 덕성여자대학교(2019년)로부터 연구비를 지원받아수행되었으므로 이에 감사드립니다. 천식 혈청을 제공하여 주신한양대학교 의과대학 윤호주, 김상헌 교수님께 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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