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A Comparison Study on Charge Variant Assays of Recombinant DNA-derived Biologics Approved in Korea
Yakhak Hoeji 2020;64(1):73-78
Published online February 29, 2020
© 2020 The Pharmaceutical Society of Korea.

Joon Ho Eom*, Jounghee Baek**, Young Ki Hong*,***, Aera Son*,***, Soyeong Kang*,***, Hokyung Oh*, Min-Jung Kim*, Jeong-Nam Woo*, and Chiyoung Ahn*,#

*Advanced Therapy Products Research Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
**Cell and Gene Therapy Products Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation
***College of Pharmacy, Chungbuk National University
Correspondence to: Chiyoung Ahn, Advanced Therapy Products Research Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Cheongju 28159, Republic of Korea
Tel: +82-43-719-4751, Fax: +82-43-719-4750 E-mail: cahn@korea.kr
Received November 1, 2019; Revised January 2, 2020; Accepted February 14, 2020.
Abstract
Analysis on approval documents of recombinant DNA-derived biopharmaceuticals (172 items) marketed in Korea showed as followed. First of all, antibody drugs are about 37% among the biopharmaceuticals and most of antibodies as a major ingredient (about 92%) are humanized or human type. Second, charge variant assays using in quality (purity) test are distinctly different between antibody drugs and non-antibody drugs. The former prefer CEX and cIEF, the latter IEF and CZE. The preference difference may be related to size and complexity of target molecules. Third, the result of analysis on usage of 4 assays (CEX, CZE, IEF, and cIEF) in accordance with approval period indicated that cIEF usage got increased since 2010 and was about 50% after 2015. And finally, acceptance criteria of charge variant assays showed a few distinguished patterns independent of drug products. In the light of these facts, whether or not to establish a charge variant method and acceptance criteria as a quality test, and which method to use may depend on the characteristics of the product and analysis conditions of other manufacturers. In particular, in biopharmaceuticals that contain polymer proteins as the main component, such as antibodies, charge variant analysis is important, and the use of modern analytical methods such as the icIEF method is expected to increase.
Keywords : Charge variant, biopharmaceutical, quality test, purity
서 론(Introduction)

전 세계 의약품 시장(약 1조2천억 달러, 2018년)에서 바이오의약품이 차지하고 있는 비중은 약 28%이다. 국내의 경우 바이오의약품은 전체 의약품 시장(약 20조원, 2017년)에서 약 10%의 비중을 차지하고 있어 아직 미약한 수준이지만 빠른 성장을 보이고 있다. 다른 한편 바이오의약품 내에서 유전자재조합기술을 이용하여 생산되는 단백질의약품의 비중은 약 41%에 이르는 것으로 추산되고 있다.1)

유전자재조합의약품의 주성분은 재조합유전자가 도입된 동물세포(예 CHO 세포)에서 생산되는 항체, 호르몬, 싸이토카인 등의 단백질이다. 단백질 성분은 세포내 생합성 과정과 단백질 분리 등 제조공정을 거치면서 다양한 변형 과정이 일어나기 때문에 최종 산물의 전기적 성질은 일반적으로 동질적이지 않고 이질적이다. 또한 전기적 이질성(charge heterogeneity)은 의약품의 보관 과정에서도 추가될 수 있다. 이와 같이 특정 단백질 성분의 제조 및 보관 과정에서 불가피하게 생기게 되는 다양한 전기적 변이체들을 전하변이체(charge variants)라 한다.

전기적 이질성은 물리화학적 또는 효소적 과정에 의해 유발될 수 있는데 예를 들면, 이황화결합(disulfide bond) 형성, glycosylation, N-말단 글루타민의 고리화반응(cyclization), C-말단 라이신의 탈아미노반응(deamination), 산화, 당결합반응(glycation),펩티드결합 절단 등이 있다.2) 이때 탈아미노반응이나 시알산 결합반응(sialylation) 등은 단백질의 순음전하(net negative charge)를 증가시킴으로써 그리고 C-말단 라이신 절단은 순양전하(net positive charge)를 감소시킴으로써 산성 변이체(acidic variants) 생성을 유발하는 것으로 알려져 있다.3) 또한 제조 과정의 배양 배지이나 보관 시 제형액에 존재하는 당 성분(포도당, 젖당 등)이단백질(예, 라이신의 아민기)에 공유결합(glycation)되어 산성 변이체(acidic variants) 생성을 유발하기도 한다. 다른 한편 C-말단라이신 또는 글리신의 아미드기화(amidation) 및 숙신기화(suc-cinimidation), 아미노산 산화, 시알산 제거 등은 순양전하를 증가시키거나 순음전하를 감소시킴으로써(둘다 pI를 증가시킴) 염기성 변이체(basic variants) 생성을 유발한다.2)

유전자재조합의약품의 제조 및 보관 과정에서 생성되는 전하변이체들은 의약품의 효능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 엄격하게 관리될 필요가 있다.4, 5) 따라서 의약품 제조사는 허용가능한 전하변이체의 범위를 정하고 이의 점검을 품질관리 과정에 포함시키고 있다. 일반적으로는 이를 규격 항목 중 순도에 포함시키나 제조사에 따라 별도의 품질 항목으로 정하기도 한다.6)

품질관리 과정에서 전하변이체를 분석하는 방법에는 크로마토그래피법과 전기영동법이 있으며 전자의 경우는 이온교환크로마토그래피법(ion exchange chromatography, IEX) 후자의 경우는 모세관 띠 전기영동법(CZE, capillary zone electrophoresis), 모세관 등전점 집속법(CIEF, capillary isoelectric focusing) 등이 일반적이다.

이온교환크로마토그래피법은 고정상의 이온기와 분석물질 표면의 이온기간의 정전기적 상호작용에 의해 물질을 분리분석하는 방법이다. 일반적으로 이동상의 염 농도나 pH를 변화시킴으로써 정전기적 상호작용에 영향을 주어 분석물질들의 분리시간,분리도 등에 영향을 줄 수 있다. 이온교환크로마토그래피법은고정상의 이온기가 (−) 전하를 띤 경우, 양이온교환크로마토그래피법(cation-exchange chromatography, CEX) 그리고 고정상의 이온기가 (+) 전하를 띤 경우에는 음이온교환크로마토그래피법(anion-exchange chromatography, AEX)으로 구분된다. 전하변이체 분석시에는 보통 CEX법이 많이 사용되며 이 경우, 산성 변형체는 주피크 앞에 그리고 염기성 변형체는 주피크 뒤에 검출된다.7)

모세관 전기영동법은 전기장이 걸린 모세관형 겔 내에서 나타나는 분석물질들의 이동 양상 차이를 이용하여 물질을 분리분석하는 방법이다. CZE (capillary zone electrophoresis)법은 겔내의 물질이동속도가 분석물질의 전하, 크기, 모양 등에 의해 달라지는 특성을 이용한다. CIEF (cIEF, capillary isoelectric focus-ing)법은 전기장에 의해 겔 내에 순간적으로 형성되는 pH 기울기로 인해 분석물질들이 각자의 pI와 일치하는 pH까지만 이동하게 되는 현상을 이용하여 전기적 성질이 다른 분자들을 분리한다. 최근에는 이미지화 기술을 적용한 최신 cIEF법인 icIEF (imaged capillary isoelectric focusing)법이 활용되는 추세이다.8)

본 연구에서는 국내에 허가된 유전자재조합 단백질의약품 전체의 전하변이체 분석법에 대한 활용 경향 및 기준 현황을 조사하여 제시함으로써 국내 유전자재조합의약품 품질관리 역량강화에 유용한 기초 자료를 제공하고자 한다.

연구 방법(Research Methods)

연구대상

본 연구에 포함된 연구대상은 2019 년 9월말 현재까지 국내에 허가된 유전자재조합의약품으로 백신, 혈액제제 등 생물학적제제는 제외하였다.

연구자료의 범위

본 연구에 사용된 자료는 국내에서 허가된 유전자재조합의약품(총 172 품목)의 기준 및 시험방법이다. 이 허가 자료를 바탕으로 각 품목별로 확인, 순도, 함량, 역가 등 품질평가 시험의 실제 기준과 시험방법을 정리하였다. 정리된 자료로부터 전하변이체 시험이 포함된 품목을 추출하였으며 품목은 제품명을 기준으로 정리하였다. 따라서 하나의 품목에 주성분은 동일하나 용량, 제형 등이 다른 제품들이 포함될 수 있다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

국내 유전자재조합 단백질의약품 허가 현황

백신 등 생물학적제제를 제외하고 국내에서 판매허가된 유전자재조합의약품은 총 172품목(제품명 기준, 2019년 9월말 현재)이며 주성분은 항체, 호르몬, 싸이토카인 등이다. 항체의약품은 총 64품목인데 항체 유형별로 구분하면 mouse 형은 없고, chimeric형 12.5%, 인간화 형 39%, 인간 형 34.4%, fusion 형 7.8%, ADC (antibody-drug conjugate) 형 6.3% 등이다(Fig. 1). 특히 2014년이후 허가 품목이 크게 증가하였는데 이를 항체 유형별로 구분해보면, chimeric 형은 미미하고 인간화 및 인간 형이 압도적 다수(2014년 이후, 33개 품목, 92%)를 차지하고 있다. 이것은 면역원성 등 제품의 안전성 강화 추세가 반영된 결과라 생각된다(Fig. 2).5) 비항체 유전자재조합의약품의 주성분은 상당수가 호르몬류(69%)이며 나머지는 싸이토카인, 효소 등이었다.

Fig. 1. Percentage of antibody types among antibody drugs approved in Korea.
Fig. 2. Yearly case by antibody type in antibody drugs approved in Korea.

다른 한편 최근 주목받고 있는 바이오시밀러의 국내 허가 품목수는 총 12개(제품명 기준)인데 이중 국내사가 개발한 제품은 9개 품목(항체의약품 8개 품목)이다(Table 1). 2012년에 셀트리온이 개발한 세계 최초의 항체 바이오시밀러(램시마)가 판매허가된 이후 국내 바이오시밀러산업은 비약적으로 발전하여 세계판매액 순위 10위안에 있는 6개의 항체의약품들 중 아바스틴(베바시주맙, (주)로슈)을 제외하고 모두 국내사에 의해 바이오시밀러가 개발생산되고 있다.

Approval status of biosimilars in Korea (Sep. 2019)

# Biosimilar Original (main component) Manufacturer Approval Development/Import Indication
1 Remsima Remicade (infliximab) Celltrion ’12.07.20 Development Rheumatoid arthritis
2 Herzuma Herceptin (trastuzumab) Celltrion ’14.01.15. Development Breast cancer
3 Scitropin Genotropin (somatropin) SciGen Korea ’14.01.28. Import Growth failure
4 Etoloce Enbrel (etanercept) Samsung Bioepis ’15.09.07 Development Rheumatoid arthritis
5 Basaglar Lantus (insulin glargine) Lilly ’15.11.25 Import Diabetes
6 Remaloce Remicade (infliximab) Samsung Bioepis ’15.12.04 Development Rheumatoid arthritis
7 Truxima Rituxan (rituximab) Celltrion ’16.11.16 Development Rheumatoid arthritis
8 Hadlima Humira (adalimumab) Samsung Bioepis ’17.09.20 Development Rheumatoid arthritis
9 Samfenet Herceptin (trastuzumab) Samsung Bioepis ’17.11.08 Development Breast cancer
10 Glarzia Lantus (insulin glargine) GC Korea ’18.03.07 Import Diabetes
11 Eucept Enbrel (etanercept) LG Chem ’18.03.16 Development Rheumatoid arthritis
12 Nesbell Nesp (darbepoetin alfa) CKD ’18.11.29 Development Anemia


전하변이체 분석법 비교

가) 제품종류에 따른 분석법 차이

품질평가 시험으로 전하변이체 분석법을 설정하고 있는 품목은 전체 172개 품목 중 75개 품목(약 44%)이었으며, 이를 주성분이 항체인 제품군과 비항체인 제품군을 나누어 비교해보면 각제품군에서는 각각 86% 및 19%의 품목들이 전하변이체 분석을 시험항목으로 설정하고 있었다. 설정된 전하변이체 시험법은 대부분 확인 또는 순도 항목에 포함되어 있었으나 품목에 따라 영상화 모세관 등전점 전기영동, 등전점 전기영동, 전하이질성, 전하이질성시험, heterogeneity, charge heterogeneity 등의 명칭의 별도 항목으로 설정된 경우도 있었다. 설정된 전하변이체 시험법의 종류에는 CEX, CZE, IEF, cIEF 등 네 가지가 있었으며, 활용되고 있는 시험법 중 CEX법이 가장 많았고, cIEF법, IEF법이 그 뒤를 따랐으며, CZE법이 가장 빈도가 적었다. 하지만 주성분이 항체인 제품군과 비항체인 제품군을 나누어 비교해보면 뚜렷한 차이가 나타났다. 즉 항체 제품군에서는 CEX법(51%)과cIEF법(27%)이 선호되었으나 비항체 제품군에서는 IEF법(60%)과 CZE법(20%)이 주로 사용되는 것으로 조사되었다. cIEF법은 비항체 제품군에서는 가장 활용도가 낮은 시험법(5%)인 것으로 나타났다(Fig. 3).

Fig. 3. Usage(%) of charge variant assays among drug products.

(1) CEX: cation exchange high performance liquid chromatography (2) cIEF: capillary isoelectric focusing (3) IEF: isoelectric focusing (4) CZE: capillary zone electrophoresis



사용되고 있는 전하변이체 분석법이 앞서 언급한 바와 같이 항체 제품군과 비항체 제품군에서 큰 차이를 보이고 있는 이유는 주성분 단백질의 크기 및 복잡성과 관련이 있는 것으로 추정된다. 즉 항체 분자의 크기(약 100~200 kD)와 복잡성이 비항체 단백질(약 20~30 kD)에 비해 매우 크기 때문에 제조 및 보관 과정에서 전기적 성질이 다른 다양한 변이체들이 생겨날 가능성이 크다. 따라서 품질관리 측면에서 항체 제품군은 전하변이체를 모니터링할 필요성이 더 크다. 비항체 제품군에서 주로 사용되고 있는 IEF법은 분석기기를 사용하는 방법이 아니라 평판겔을 만들어 분석하는 고전적 방법으로 정량 분석에 활용하기에는 많은 단점을 가지고 있다. 그럼에도 불구하고 비항체 제품군에서 이 분석법의 활용도가 높은 것은 cIEF 분석기기가 고가인 점, 유사 선행 제품과의 분석 일관성 등이 영향을 준 것으로 추정된다. 하지만 cIEF법은 분석시간 및 정밀성 등에서 장점이 크기 때문에 향후에는 비항체 제품군에서도 cIEF법 활용이 고려될 것으로 예상된다. cIEF법 활용이 증가될 것이란 예상은 2015년 이후 허가된 제품에서는 cIEF법(48%)이 IEF법(11%)은물론 CEX법(41%) 보다 더 많이 활용되고 있다는 사실에서도 확인되고 있다.

나) 허가 시기에 따른 분석법 변화

국내 허가된 유전자재조합의약품의 전하변이체 분석에 활용되고 있는 네 가지 분석법 즉 CEX, CZE, IEF, 그리고 cIEF법은 각각 장단점을 가지고 있어 분석대상물질의 종류, 분석기기의 활용 용이성, 새로운 기술의 도입 등 다양한 요인에 의해 활용 정도가 달라진다. 전하변이체 분석법 중 특히 cIEF법은 최근 분석시간을 단축하고 정확성을 향상시킬 수 있는 새로운 기술이 적용되어 기술적으로 큰 도약이 있었다. 이 기술은 모세관전기영동 전체 패턴을 이미지화하여 검출되는 분석물질들을 동시에 분석하는 것으로 이를 적용한 분석기기가 상용화된 것은 2000년이다. 그리고 이와 같이 이미지 분석 기술을 활용한 새로운 cIEF법을 특히 icIEF (imaged capillary isoelectric focusing)법이라 한다.

전하변이체 분석기술과 관련하여 실용적인 측면에서 icIEF 분석기기가 상용화된 2000년이 중요하다는 판단에 따라 시기에 따른 분석법 추세를 확인하기 위한 기준 시점을 2000년으로 정하였다. 이에 따라 분석 시기를 2000년 이전, 2000~2004년, 2005~ 2009년, 20102~014년 그리고 2015년 이후 등 5개 시기로 구분하였다.

이와 같은 시기 구분을 바탕으로 분석한 결과, 2000년 이전에는 CZE법만이 전하변이체 분석에 사용되었으나 2000~2009년에는 CEX법과 IEF법이 주로 활용되었음을 확인할 수 있었다. 그리고 2010년부터는 cIEF법의 활용이 증가되기 시작하여 2015년 이후에 허가받은 유전자재조합 제품들에서는 가장 많이 활용되는 분석법인 것으로 조사되었다. 그리고 이때 cIEF법은 모두 최신 기술을 적용한 icIEF법인 것으로 확인되었다(Fig. 4).

Fig. 4. Usage change of charge variant assays by approval periods.

(1) CEX: cation exchange high performance liquid chromatography (2) cIEF: capillary isoelectric focusing (3) IEF: isoelectric focusing (4) CZE: capillary zone electrophoresis



전하변이체 시험의 기준 분석

전하변이체 분석은 유전자재조합의약품 품질평가 항목 중 확인 및 순도 분석을 위해 활용되며 비록 별도의 항목명을 사용한다 할지라도 개념적으로는 확인 또는 순도 분석을 위한 것이라 할 수 있다. 일반적으로 확인 항목의 기준으로는 분석 결과물의 패턴 유사성(또는 동일성), 특정 물질(피크)의 존재 유무 등 정성적 특성이 설정된다. 그러나 전하변이체 시험이 사용되는 경우에는 정성적 특성 외에 정량적 측정값이 기준으로 설정되기도 하였다.

전하변이체 분석에서는 확인 및 순도 기준을 별도로 정하기도 하지만 많은 경우, 하나의 시험을 통해 확인과 순도를 동시에 평가하기 때문에 두 시험항목이 같은 기준을 공유하기도 한다. 허가 자료 분석을 통해 얻은 각 분석법별 기준 유형과 그 예시를 Table 2에 정리하였다.

Types of acceptance criteria in charge variant assays

1) CEX-HPLC(cation exchange high performance liquid chromatography) and cIEF(capillary isoelectric focusing)

Criteria type Example

Identity/Purity Area percentage of main and total area percentage of other peaks Area percentage of main peak; 43.0~65.0%,
Total area percentage of acidic variant peaks; 10.0~25.0%,
Total area percentage of basic variant peaks; 16.0~41.5%

Each area percentages of main and other peaks Total area percentage of acidic variant peaks; ≤13.0%
Acidic variant peak 1; ≤9.2%
Peak right in front of main peak; ≤3.0%
Main peak; ≥55%
Total area percentage of basic variant peaks; ≤20.0%
Basic variant peak 1; ≤10.0%
Basic variant peak 2; ≤14.5%

Area percentage of main peak Main peak; ≥70%

Sum of area percentages of other peaks except main peak Sum of area percentages of other peaks except main peak; ≤5%

Area percentage of specific peak except main peak Deamidated variant; ≤25%

Identity Peak pattern similarity Similar peak pattern between standard and sample

Difference of retention time or pI value of main peak , peak 1 and peak 2 between standard and sample; ≤ ±2%

2) IEF (isoelectric focusing)

Criteria type Example

Identity/Purity Area percentage of main band and positions of other bands Equal position of major bands (3-9) between standard and sample
Sum of area of major bands (3-9); ≥82% of total band area

Each area percentages of main and other bands Main band; ≥90% and deamidated band; ≤5%

Area percentage of main band Main band; ≥93.0%

3) CZE (capillary zone electrophoresis)

Criteria type Example

Identity/Purity Each area percentages of main and other peaks Main peak; ≥50.0%
Total area percentage of acidic variant peaks; ≤40.0%
Total area percentage of basic variant peaks; ≤10.0%

Sum of area percentages of other peaks except main peak Charged variants; ≤11.5%

Sum of area percentages of other peaks except main peak & area percentage of specific peak Total area percentage of charge variants; ≤18%
Area percentage of deamidated peak; ≤15%


조사된 전하변이체 시험의 기준은 분석 방법에 따라 표현 방식은 다르지만 기본 개념적으로는 유사했다. 즉 순도 분석의 경우, 대표적인 기준은 첫째, 주피크, 산성 변형체 및 염기성 변형체 각각의 면적백분율 둘째, 주피크(밴드) 이외 피크(밴드)들의 면적백분율 합 또는 각 피크(밴드)들의 면적백분율 셋째, 특정 피크(밴드)의 면적백분율 등이 있었다. 특히 CEX법과 cIEF법은 설정된 기준 양상이 매우 유사하였다. 다른 한편 확인 시험의 경우는 순도 시험 기준을 그대로 적용하는 경우도 있었지만 주로 표준품과의 피크(밴드) 패턴 유사성 또는 주피크(밴드)의 존재 유무가 기준으로 설정되어 있었다.

품질시험 항목으로 전하변이체 시험 및 기준을 설정할지 여부 그리고 어떤 분석법을 활용할지의 여부는 제품의 특성 그리고 그 외 제조사의 분석 여건에 따라 달라질 수 있다. 특히 항체와 같이 고분자 단백질을 주성분으로 하는 생물의약품의 경우, 전하변이체 시험은 중요하며 icIEF법 등 최신 분석법의 활용 증가가 예상된다.

결론(Conclusion)

본 연구에서는 국내 허가된 유전자재조합의약품 전체의 품질관련 허가심사자료 분석을 통해 다음과 같은 결과 및 시사점을 확인할 수 있었다. 첫째, 허가된 항체 제품군의 비중은 약 37%이며 2014년 이후 허가된 제품 중 인간화 및 인간형이 대부분(약 92%)을 차지하고 있으며, 둘째, 품질평가를 위해 활용되고 있는 전하변이체 분석법은 항체 제품군과 비항체 제품군에서 뚜렷한 차이를 보여 전자는 CEX법과 cIEF법이 후자의 경우는 IEF법과 CZE법이 선호되고, 이는 분석대상물질의 크기 및 복잡성과 관련이 있는 것으로 추정된다. 세 번째로는 전하변이체 분석에 활용되고 있는 네가지 분석법 즉 CEX, CZE, IEF, 그리고 cIEF법에 대한 허가 시기별 활용 비중 분석 결과, 2010년 이후 cIEF법의 뚜렷한 비중 증가를 확인할 수 있었고 2015년 이후에는 cIEF법이 약 50%의 비중을 차지하는 것으로 조사되었다. 마지막으로 제품에 따른 전하변이체 품질 기준은 사용되고 있는 분석법과 상관없이 몇가지 유형으로 구분할 수 있었다.

다른 한편으로 순도 분석은 제품의 품질관리에서 매우 중요한 요소이기 때문에 향후 시험연구를 통해 동일한 제품에 대해 어떤 종류의 분석 방법이 실질적으로 순도를 정확하게 평가할 수 있는지 여부를 명확하게 검증해 볼 필요가 있을 것으로 사료된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

본 연구는 식품의약품안전처의 연구개발비(19171MFDS162)로 수행되었다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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February 2020, 64 (1)
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