Statin 계열 약물은 이상지질혈증 및 고지혈증에 광범위하게 사용되는 치료제로, HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) 환원효소 억제제이다.¹⁾ HMG-CoA 환원효소 억제제는 콜레스테롤의 생합성 과정 중 속도결정단계인 HMG-CoA가 mevalonate로 변환되는 단계에 관여하는 효소를 억제하여 콜레스테롤의 생합성을 저해하는 약물로 혈중 총콜레스테롤과 LDL을 감소시킨다.²⁾ 콜레스테롤은 세포막을 구성하는 중요한 요소로, 암세포가 세포 분열로 세포의 수를 늘리기 위해서는 세포막을 구성하는 지방산과 콜레스테롤의 합성을 늘려야 한다.³⁾ 한편, mevalonate 경로에서 생성되는 중간 대사산물이, 암세포의 증식 유지와 촉진에 중요한 역할을 담당하고 있음이 보고된 바 있다.^4,5) 이에 따라 최근 mevalonate 경로는 암세포의 증식에 연관되어 있으며 HMG-CoA를 억제 시킴으로써 항암 효과를 얻을 수 있음이 밝혀지고 있다.^4,5)

임상 시험 결과에 따르면, atorvastatin은 같은 statin 계열의 약물인 simvastatin에 비해 향상된 효능과 감소된 부작용을 보이는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 또한 atorvastatin의 투여는 암의 재발 및 사망 위험 감소와 상관관계가 있으며 세포 사멸, 항증식 효과, 세포 성장 억제 및 세포 주기를 조절할 수 있는 것으로 보고 되었다. 난소암 세포증식 억제, 유방암 증식 억제, 간세포 암종 및 결장직장 암종 세포에서 자가포식 유도 등으로 인한 항암 효능이 알려져 있다.^7,8,9,10) 또한 doxorubicin, cisplatin, paclitaxel, topotecan, bevacizumab 및 celecoxib와 같은 항암제와 병용 투여시 다양한 유형의 암에서 암세포 증식 억제, 신생 혈관 억제, 세포 사멸 작용을 나타낼 수 있음이 보고되었다.¹¹⁾ 따라서 atorvastatin은 암 치료에 사용할 수 있는 잠재적인 항암 치료제로 각광받고 있다.¹¹⁾

암 치료를 위한 표적 세포 사멸 경로는 다양하다. Ferroptosis는 apoptosis, pyroptosis 및 necrosis와는 다른 새로운 형태의 철의존적 프로그램 세포 사멸 경로로 최근 새로운 표적 세포 사멸 경로로 각광받고 있다.¹²⁾ Ferroptosis는 철 의존성 fenton 반응과 지질 과산화, ROS(Reactive oxygen speicies) 생성을 포함하는 세포사멸 과정이다.¹³⁾ Fe³⁺ 이온은 세포 밖에서 철 수송체인 transferrin 당단백질과 결합하고, transferrin receptor를 통하여 세포 내로 유입되게 된다.¹³⁾ 세포 내로 유입된 Fe³⁺는 Fe²⁺로 환원되며 세포 내로 축적되어 증가된 철 이온은 과산화수소(H₂O₂)와의 fenton 반응을 촉진하여 ROS를 생성한다.¹⁴⁾ 한편, 세포막의 다중불포화 지방산(PUFA-LPs-OH)은 ROS와 lipoxygenase에 의해 산화되어 지질 과산화(PUFA-LPs-OOH)를 형성하고, 이는 지질 자유 라디칼을 생성하여 세포 사멸을 초래한다.¹⁵⁾ 또한, PUFA-LPs-OOH는 GPX4 (Glutathione peroxidase 4)에 의해 무독성 PUFA-LPs-OH로 환원된다.¹⁶⁾ GPX4는 ferroptosis의 핵심 조절 인자인데, 세포 내 항산화제 시스템인 GSH-GPX4 시스템은 ROS 생성을 조절할 수 있다.¹⁷⁾ SLC7A11과 SLC3A2를 포함한 시스템 Xc는 세포 외부에 있는 Cystine (Cys)를 세포 내부로, 세포 내부에 있는 Glutamic acid (Glu)를 세포 외부로 수송하는 수송체이다.¹⁷⁾ 이러한 수송체는 세포 내부에 Cys 수준을 증가시켜 GSH를 활성화한다.¹⁷⁾ 활성화된 GSH는 GPX4를 활성화시켜 세포내 ROS 수준을 감소시킨다.¹⁷⁾

Ferroptosis는 statin 계열의 약물이 정상세포나 근육 세포의 부용을 일으키는 기전 중 하나로 알려지기 시작했으며 ferroptosis의 조절 메커니즘과 신호 경로가 명확해짐에 따라 ferroptosis의 항암 치료에서의 응용 방안이 각광 받기 시작하고 있다.¹⁸⁾ 그러나 다양한 암세포에서 효과적으로 ferroptosis를 유도하는 약물의 종류 및 그 세부 기전 규명에 대한 연구는 아직 초기 단계이다. Ferroptosis의 기전에 따르면 fenton 반응의 조절과 GPX4 효소의 억제 활성은 종양 세포에서 ferroptosis를 유도하는 가장 효과적인 전략이다. 이에 따라, 일부 ferroptosis 유도제는 효과적인 항암제로 활용될 수 있는 가능성이 있다. 이러한 약물은 주로 GPX4 분해 및 GSH 고갈을 유도하는 시스템Xc 억제제(erastins, sulfasalazine 및 sorafenib) 및 GPX4 억제제(RSL3 및 altretamine)가 포함된다. 일부는 임상적으로 승인 받았지만, 대부분은 용해도가 낮고, 비특이적 분포, 예측 불가능한 부작용 등으로 항암제로 활용하기 위한 추가 연구가 필요하다.¹⁹⁾

현재까지 atorvastatin에 의한 항암 효과를 확인한 연구 결과가 많으나 어떠한 기전으로 이런 효과를 보이는지에 대한 연구는 부족한 상황이다.

본 연구에서는 B16F10.OVA cell에서 atorvastatin에 의해 유도된 항암 효과를 확인하고 atorvastatin이 B16F10.OVA의 ferroptosis를 유도할 수 있음을 최초로 보고하고자 한다. 이를 확인하기 위해 ferroptosis의 다양한 바이오마커와 신호 경로들을 확인하고 추가로 apoptosis와 ICD의 마커를 확인하여 세포 사멸 기전을 규명하였다.

재료 및 시약

FBS는 (Gibco^TM)에서 구입하여 사용하였다. Penicillin/streptomycin, DMEM은 (WELGENE, Gyeongsan-si, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Atorvastatin은 목포대학교 박진우 교수 연구실에서 공급받아 사용하였다. Ferrostatin-1, RSL3, PVDF (polyvinylidenedifluoride) membrane, Tween 20은 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에서 구입한 후 사용하였다. GPX4 monoclonal antibody, beta actin monoclonal antibody은 (Cell signaling, Danvers, MA, USA)에서 구입한 후 사용하였다. Goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody HRP conjugate (Enzo Life Sciences, New York, USA)에서 구입한 후 사용하였다. West Pico Plus Chemiluminescent Substrate, H2DCF-DA는 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 구입한 후 사용하였다. Skim milk, Apoptosis kit는 (BD DIFCO^TM, Franklin Lakes, New Jersey, USA)에서 구입한 후 사용하였다. CETi lysis buffer은 (TrasnLab, Daejeon, Korea)에서 구입한 후 사용하였다. CCK-8 kit, FerroOrange는 (Dojndo, Kumamoto, Japan)에서 구입한 후 사용하였다. PE anti-mouse calreticulin은 (Novus biologicals LLC a BioTechne Brand, Easter Ave, Centenial, USA)에서 구입한 후 사용하였다. 10 mm cell culture dish, 96well plate, 12well plate, Scraper는 (Spl Life Sciences, Pochenon-si, Korea)에서 구입한 후 사용하였다.

세포 배양

B16F10.OVA 세포는 한국과학기술원(KIST) 김인산 박사 연구실에서 제공받아 사용하였으며, 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS 및 1% penicillin/streptomycin 이 포함된 DMEM 배지에 배양하였다. 12 well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하고 15시간 배양한 후 약물을 atorvastatin (10, 50, 100 μM), atorvastatin 100 μM+Ferrostatin1 1 μM, 처리 후 24시간 동안 배양하였다.

Cell viability

세포 생존율을 확인하기 위해 B16F10.OVA 세포를 96well plate에 1×10⁴ cells/well로 분주하였다. 세포가 70% confluent 할 때, atorvastatin (10, 50, 100 μM), atorvastatin 100 μM+Ferrostatin1 1 μM, 처리 후 24시간 동안 추가 배양하였다. CCK8 kit를 사용하였으며 30분간 37°C에서 배양하여 microplate reader (Molecular Devices Co., Ltd., USA)를 이용하여 450 nM의 파장으로 흡광도를 측정하였다.

세포 내 철 축적 측정

약물 처리 배양이 종료된 후, 배지를 제거하고 세포를 수확하여 세포 내 Fe²⁺을 확인할 수 있는 시약인 FerroOrange을 1μM의 농도로 처리하고, 37°C, 30분 염색하였다. 염색이 끝난 후 PBS buffer로 2번 세척한 후 FACS (Flow cytometry, Agilent Technologies Co. Ltd., USA)를 이용하여 분석하였다.

세포 내 활성 산소량 측정

약물 처리 배양이 종료된 후, 배지를 제거하고 세포를 수확하여 세포 내에서 생성되는 활성 산소를 측정할 수 있는 시약인 H2DCF-DA를 10 μM의 농도로 처리하고, 37°C, 30분 염색하였다. 염색이 끝난 후 PBS buffer로 2번 세척한 후 FACS (Flow cytometry, Agilent Technologies Co. Ltd., USA)를 이용하여 분석하였다.

Apoptosis analysis

약물의 반응시간이 종료된 후, 배지를 제거하고 세포를 수확하여 apoptosis kit를 이용하여 상온에서 30분 동안 염색하였다. 염색이 끝난 후 FACS buffer로 2번 세척한 후 FACS (Flow cytometry, Agilent Technologies Co. Ltd., USA)를 이용하여 apoptosis 세포를 분석하였다.

세포 표면의 calreticulin 발현 측정

약물 처리 배양이 종료된 후 배지를 제거하고 세포를 수확하여 calreticulin의 발현을 측정하기 위해 PE anti-mouse calreticulin을 100:1의 비율로 사용해 4°C, 30분 염색하였다. 염색이 끝난 후 FACS buffer로 2번 세척한 후 FACS (Flow cytometry, Agilent Technologies Co. Ltd., USA)를 이용하여 분석하였다.

Western blot analysis

10 mm cell culture dish에 B16F10.OVA 세포를 배양 후, atorvastatin (10, 50, 100 μM), atorvastatin 100 μM+Ferrostatin1 1 μM, 처리 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 CETi lysis buffer를 100 μL 넣고 scraper로 긁어 세포를 수확하였다. 세포수확물을 v ortex 하여 ice에서 15분 방치 후 13,000 rpm, 4°C에서 15분간 원심분리하여 상층액만 수확하였다. 수확한 상층액을 10% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 하였다. Gel 상에서 분리된 단백질들을 PVDF (Polyvinylidenedifluoride) membrane에 transfer 시켜 5% skim milk로 1시간 blocking 하였다. 그 후, 0.1% Tween 20을 포함한 TBS-T buffer로 5분, 5번 세척 하였다. TBS-T buffer에 primary antibody를 1000:1로 희석하여 4°C에서 반응시켰다. 0.1% Tween 20을 포함한 TBS-T buffer로 10분 3번 세척 후, secondary antibody를 가하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질 밴드는 West Pico Plus Chemiluminescent Substrate를 사용하여 반응시킨 후 단백질 밴드를 확인하였다.

통계학적 분석

모든 실험은 3번 반복 실험을 하였고, 통계적 유의성은 oneway ANOVA 및 student’s t-test 이용하여 분석하였다. Probability(p) 값의 p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 분석하였다.

B16F10.OVA 세포에서 atorvastatin에 의해 유도된 세포 생존률 확인

Atorvastatin의 세포 독성 및 IC50을 확인하기 위하여 B16F10.OVA 세포에 atorvastatin을 저농도에서 고농도로 처리한 후 24시간 배양하였다. 대조군 대비 atorvastatin을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다(Fig. 1A, B). 또한 atorvastatin의 IC50은 49.89 μM로 확인되었다(Fig. 1A).

Fig. 1. Atorvastatin IC50 & Live/Dead cell viability assay. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of atorvastatin ranging from 10 μM-1 mM for 24 hours. Cells were treated with CCK-8 solution for 30 mins. Each bar represents a mean±S.E.M. Three independent experiments were performed, and the representative data were shown. (B) B16F10.OVA cells were stained with Calcein AM. Fluorescence images were shown. Statistical significance was marked as *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001.

Atorvastatin에 의한 세포 내 철 축적 확인

Atorvastatin에 의해 유도된 ferroptosis를 확인하기 위해 먼저 ferroptosis의 marker인 세포 내 철 축적을 관찰하였다. 세포 내 철 축적 관찰을 위해 ferroOrange 시약을 사용하여 atorvastatin을 처리한 실험군을 염색하였고, 유세포분석을 이용하여 철 축적을 분석하였다. RSL3의 농도는 IC50 값을 기준으로 IC50 값보다 낮은 농도를 사용하였다(Supplementary Fig. 1). Atorvastatin 100 μM을 처리한 실험군은 대조군보다 세포 내 철 축적이 약 7% 증가하였고, 농도 의존적으로 철 축적이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2A, B).

Fig. 2. Atorvastatin increases Fe²⁺ accumulation. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of atorvastatin, ferrostatin-1 and RSL3 for 24h. Cells were stained with ferroOrange to quantify the amount of Fe²⁺. The percentage of Fe²⁺ accumulation derived from the histogram of the flow cytometry analysis are shown in representative images. (B) Quantification of the percentage of Fe²⁺ accumulation derived from the histograms in panel (A). The data are shown as mean±SEM (n=3). Statistical significance was marked as *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001

Atorvastatin에 의해 유도된 세포 내 활성 산소 생성량 확인

Ferroptosis의 또 다른 marker인 세포 내 활성 산소의 발생을 측정하였다. 활성 산소를 측정할 수 있는 H2DCF-DA 시약을 atorvastatin을 처리한 실험군에 염색한 후 유세포분석을 이용하여 활성 산소생성량을 분석하였다. 대조군 대비 atorvastatin 100 μM을 처리 한 실험군에서 활성 산소 생성량이 약 6% 증가하는 것을 확인하였고, 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰하였다(Fig. 3A, B).

Fig. 3. Atorvastatin increases ROS generation. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of Atorvastatin, Ferrostatin-1, RSL3 for 24h. Cells were stained with H₂DCF-DA to quantify the ROS generation. The percentage of ROS derived from the histogram of the flow cytometry analysis are shown in representative images. (B) Quantification of the percentage of ROS derived from the histograms in panel (A). The data are shown as mean±SEM (n=3). Statistical significance was marked as *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001

B16F10.OVA에서 atorvastatin에 의한 apoptosis 유도 확인

Atorvastatin에 의해 유도된 세포의 apoptosis를 관찰하기 위해 초기 및 후기 apoptosis 그리고 necrosis를 확인하였다. 후기 apoptosis를 관찰하기 위해 Annexin V와 PI로 염색하였고, 유세포분석을 이용하여 apoptosis를 분석하였다. Atorvastatin 100 μM을 처리한 실험군은 대조군에 비해 초기 apoptotic cell의 비율이 약 12%, 후기 apoptotic cell의 비율이 약 4% 증가하였고(Fig. 4A) 농도 의존적으로 apoptotic cell의 비율이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4B, C).

Fig. 4. Atorvastatin induces Apoptosis. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of atorvastatin and RSL3 for 24 hours. Cells were stained with annexin V and PI to quantify the apoptotic cells. The percentage of apoptotic cells derived from the dot plot of the flow cytometry analysis are shown in representative images. (B) Quantification of the percentage of early apoptotic cells derived from the dot plot in panel (A). (C) Quantification of the percentage of late apoptotic cells derived from the dot plot in panel (A). The data are shown as mean±SEM (n=3). Statistical significance was marked as *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001

B16F10.OVA 세포에서 atorvastatin에 의한 calreticulin 발현량 확인

Atorvastatin에 의해 유도된 calreticulin의 세포막 발현을 확인하기 위해 anti-mouse calreticulin (PE)로 염색하였고, 유세포분석을 이용하여 분석하였다. Atorvastatin 100 μM을 처리한 실험군은 대조군에 비해 calreticulin의 발현이 약 2% 증가하였으며, 농도 의존적으로 증가하였다(Fig. 5A, B).

Fig. 5. Atorvastatin increases calreticulin expression. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of atorvastatin and RSL3 for 24 hours. Cells were stained with antimouse PE-calreticulin antibody to measure calreticulin expression. The percentage of calreticulin expression derived from the histogram of the flow cytometry analysis are shown in representative images. (B)Quantification of the percentage of calreticulin derived from the histograms in panel (A). The data are shown as mean±SEM (n=3). Statistical significance was marked as *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 and ****p<0.0001

B16F10.OVA 세포에서 ferroptosis 관련 단백질의 발현에 미치는 atorvastatin의 영향

Atorvastatin을 처리하여 GPX4 단백질의 발현을 관찰하기 위해 western blot 실험을 수행하였다. 대조군보다 atorvastatin을 처리한 실험군에서 GPX4 단백질의 발현량이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다(Fig. 6A). 또한 단백질의 발현량이 농도 의존적으로 감소되었다. 결과를 종합해보면 atorvastatin이 GPX4의 발현량을 감소시켜 ferroptosis를 유도한다는 것을 알 수 있었다.

Fig. 6. Atorvastatin induces Ferroptosis via GPX4. (A) B16F10.OVA cells were treated with various concentration of atorvastatin for 24 hours. GPX4 was detected using western blotting method.

최근 수행된 연구들에서 atorvastatin을 포함한 statin 계열의 약물들이 암세포의 생존과 증식을 억제하는 항암 효능을 보일 수 있음이 보고되고 있다.⁵⁾ 그러나 atorvastain이 어떠한 기전에 의해서 암세포의 사멸을 유도하는지는 현재까지 명확하게 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 atorvastatin의 B16F10.OVA에 대한 항암 효능을 평가하고 이에 대한 기전 중 하나로 ferroptosis를 제시하였다. Ferroptosis는 최근 항암 치료에서 새로운 표적 사멸 경로로서 각광받고 있다. 그러나 ferroptosis를 일으키기 위한 약물 조건이나 ferroptosis가 일어남으로 인해 항암 효능에 기여하는 기작 등은 현재 초기 연구단계에 머물고 있다.

이번 연구에서는 atorvastatin이 B16F10.OVA 세포의 ferroptosis를 일으킬 수 있음을 규명하기 위해서 ferroptosis의 대표적인 marker들을 선정하여 대조군과 비교평가 하였다. 그 결과 atorvastatin이 B16F10.OVA 세포의 철 축적과 ROS 생성, 그리고 GPX4 단백질 발현을 조절한다는 것을 확인하였으며 이를 통해 ferroptosis를 유도하는 중요한 역할을 한다는 것을 발견하였다. Ferroptosis marker와 함께 atorvastatin 농도 의존적으로 나타난 apoptotic cell의 비율은 atorvastatin이 항암 효능을 나타낼 수 있음을 의미한다. 또한, ICD의 대표적인 marker이자 면역원성을 유발할 수 있는 calreticulin의 발현은 atorvastatin이 ICD를 유도하여 면역원성을 나타낼 수 있으며 항암 면역치료제와의 병용투여제로서의 활용 가능성도 보여 줄 수 있음을 시사한다.^20,21) 또한 최근 발표된 문헌에 의하면 ferroptosis 또한 DAMP signal 방출을 유도하여 면역원성을 유발할 수 있어 carleticulin의 발현과 ferroptosis의 관찰은 항암 면역치료의 새로운 기전을 증명함에 있어 매우 중요한 의미를 가질 수 있음을 시사한다.²²⁾ 그러나 본 연구에서는 한 가지의 세포주를 대상으로 in vitro 모델에서만 연구가 수행되었다는 점이 한계점으로 지목될 수 있으며 ferroptosis 이외에도 atorvastatin에 의해서 유도될 수 있는 다른 세포 사멸 기전이 존재할 수 있다는 점을 고려할 때, 이를 규명하기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다.

본 연구 결과를 종합할 때, atorvastatin은 B16F10.OVA 암세포의 ferroptosis를 유도하여 항암 효과를 나타낼 수 있으며 추가로 ICD를 일으킬 수 있음을 입증할 수 있었다. 이에 따라 추후 임상연구 등에서 atorvastatin의 고지혈증에 대한 효능뿐만 아니라 항암 면역치료제로서의 활용 가치를 기대할 수 있음을 밝혀내었다.

본 연구를 통해 atorvastatin 처리는 농도 의존적으로 B16F10.OVA 세포 사멸을 유도할 수 있었으며 사멸 기전 중 하나로 ferroptosis가 유도 될 수 있음을 밝혔다. Atorvastatin은 암세포 내부에 철이온을 축적하고, 활성 산소 생성량을 증가시며, 항산화제 단백질인 GPX4의 발현을 감소시켜 ferroptosis를 유도하였다. 또한, atorvastatin 처리 실험군은 대조군에 비해 apoptotic cells의 비율이 증가했으며 ICD marker인 calreticulin의 발현 또한 증가했다. 본 연구를 통해 atorvastatin이 B16F10.OVA세포의 ferroptosis를 유도할 수 있으며 ICD를 유도함에 따라 atorvastatin의 면역항암제로서의 활용 가치를 확인할 수 있음을 보였다.

본 연구는 한국연구재단에서 지원하는 ‘기초연구실 사업’ (NRF-2022R1A4A3026347)와 지역대학우수과학자 지원 사업(2022R1I1A3069739) 및 전남대학교의 지원을 받아 수행된 연구 결과이다.

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.