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Analytical Method Development for Determination of Chitosan by LC-MS/MS in Dietary Supplement
Yakhak Hoeji 2022;66(4):204-209
Published online August 31, 2022
© 2022 The Pharmaceutical Society of Korea.

Ji Eun Park and Mi Hyune Oh#

Center for Food & Drug Analysis, Gyeongin Regional Office of Food and Drug Administration, Ministry of Food and Drug Safety
Correspondence to: Mi Hyune Oh, Gyeongin Regional office of Food and Drug Safety, 137, Juan-ro Michuhol-gu Incheon 22133, Korea
Tel: +82-32-450-3325, Fax: +82-32-442-4622
E-mail: mihyuneoh@korea.kr
Received August 12, 2022; Revised August 26, 2022; Accepted August 29, 2022.
Abstract
The Ministry of Food and Drug Safety is amending its test methods for dietary supplements (functional health food) to establish regulatory standards and specifications in South Korea. In this study, we develop analytical test methods to improve the sensitivity and selectivity of the chitosan test method. We develop liquid chromatographic-tandem mass spectrometry for a chitosan analysis using acid hydrolysis to glucosamine. This method can be used to characterize and quantify dietary supplement formulations containing chitosan. The procedure was validated in the 78 ~ 2,500 ng/mL range, and standard calibration curves presented linearity with the coefficient of determination (r2) > 0.999. The limits of detection and quantitation were 51 ng/mL and 154 ng/mL, respectively. The recovery results ranged between 94.8 ~ 102.9% at three different concentration levels with relative standard deviations less than 3.1%, and precision (0.8 ~ 2.5%) was obtained. These are in accordance with the established validation criteria (Association of Official Analytical Chemists). Subsequently, our research provides scientific evidence for amending the chitosan test method for the Health Functional Food Codes.
Keywords : Chitosan, Analytical method, LC-MS/MS, Dietary supplement
서 론(Introduction)

국내 건강기능식품 시장규모는 3.11조원(2020년)으로 최근 5년간 연평균 성장률 12.4%의 지속적인 성장세를 보이고 있다.1) 이처럼 국내 건강기능식품 시장규모는 꾸준히 성장하고 있고 더불어 융복합건강기능식품 개발 등 유형, 형태 등도 매우 다양해지고 있다. 이에 식품의약품안전처(이하 식약처)에서는 우수한 건강기능식품이 제조·공급될 수 있도록 다양한 정책과 제도를 마련하여 시행하고 있다.

그 일환으로 2012년부터 건강기능식품공전(이하 공전) 시험법을 개선해 오고 있으며, 20종 이상 질량분석기를 이용한 시험법을 도입하였다. 감도와 특이성이 높은 질량분석법 이용으로 제품의 규격 관리와 시장 확대에 기여하고 소비자에게 보다 다양한 제품을 공급하고자 한다.

키토산은 갑각류(껍질), 곤충류(큐티클 층) 및 연체동물(골격)등에 있는 키틴을 고온·강알칼리로 처리하여 생성되는 천연의 고분자 물질이다. 구조는 글루코사민의 β-1,4 결합 다당체로 분자 내 유리 아미노기가 있으며, 이를 더 가수분해한 것이 키토올리고당이다.2) 키토산은 항균작용, 항암작용, 면역강화작용 등 다양한 기능이 있어3-6) 식품, 의약품 및 화장품 등 광범위한 분야에서 주목받고 있다.7-9)

공전에서 인정하고 있는 키토산/키토올리고당의 기능성 은 ‘혈중 콜레스테롤 개선과 체지방 감소에 도움을 줄 수 있음’이다. 키토산은 탈아세틸화도(당 사슬 중에 글루코사민 잔기 비율)가 80% 이상이어야 하며 키토산(글루코사민으로서)을 800 mg/g 이상, 키토올리고당은 키토올리고당을 200 mg/g 이상 함유하도록 규정하고 있다.10)

키토산은 국내에서 의약품 주성분으로는 허가 또는 신고된 사례가 없고 약전에도 수재되어 있지 않다. 분석법은 공정서로서 외국의 경우 미국약전(USP/NF) 및 유럽약전(EP)에 우리나라에서는 공전에 수재되어 있다. 공전에는 2가지 시험법이 수재되어 있는데 제1법은 시료에 산을 넣고 고온처리하여 단당류인 글루코사민으로 분해하고 발색시약으로 반응시켜 분광광도계로 측정하는 방법이다. 제2법은 제1법과 같이 시료를 산으로 글루코사민으로 분해하고 액체크로마토그래프법/시차굴절계(LC/RID)로 측정하는 방법이다.11) USP/NF에서는 NMR을 이용하여 측정하고 있고 EP에서는 정량법 대신 탈아세틸화도를 측정하고 있다.

글루코사민과 키토올리고당에 대한 분석 문헌을 참고하여12-16) 키토산에 대한 질량분석법 연구를 수행하였다. 그 결과 다양한 매트릭스와 다성분 복합제품 등을 고려한 특이성과 감도가 높은 질량분석법을 확립하였다.

방 법(Methods)

시약 및 시료

키토산 표준품(Chitosan, Poly(D-glucosamine), CAS No.: 9012-764), 글루코사민 표준품(D-glucosamine HCl, C6H13NO5·HCl, 215.63, CAS No.: 66-842) 및 시료의 전처리에 사용된 염산, 아세트산, 포름산은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 시료의 분석에 사용된 아세토니트릴은 HPLC 등급으로 Merck (Whitehouse station, USA)사로부터 구입하였다. 시험에 사용한 시료는 시중에 유통되는 건강기능식품 키토산 단성분 또는 복합성분 제품 20품목을 구매하여 사용하였다.

표준용액의 조제

키토산 표준품 50 mg을 달아 아세트산 1 mL 를 넣고 용해하고 물을 넣어 100 mL로 하였다. 이 액 10 mL를 취해 염산 7 mL, 물을 넣어 20 mL로 한 후, 이 액 5 mL를 취하고 가열기(heating block)에서 130oC로 3시간 가수분해하였다. 감압농축하여 염산 및 물을 제거하고 잔류물에 60% 아세토니트릴 5 mL를 가하여 용해하여 멤브레인 필터로 여과하여 표준원액으로 하였다. 이 용액은 60% 아세토니트릴을 이용하여 적절한 농도로 단계별 희석한 후 표준용액으로 하였다.

공전시험법 제2법 표준액조제. 글루코사민 염산염 50 mg을 달아 1% 아세트산 2.5 mL를 가하여 용해한 후, 염산 1.75 mL 및 증류수를 가하여 5 mL로 하였다. 130oC에서 3시간 가열기(heating block)로 가수분해한 후 감압농축하고 잔류물을 50% 아세토니트릴 용액 5 mL로 녹이고 표준용액으로 하였다.

시험용액의 조제

균질화한 시료를 키토산으로서 약 40 mg 해당량을 달아 표준용액과 동일하게 처리하였다.

분석장비

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)는 Waters사(Milford, MA, USA)의 Acuity UPLC System이 결합된 QUATTRO MiCRO tandem 사중극자 질량분석기(Xevo TQ-D MS Detector)를, 분석용 칼럼은 Acquity UPLC® HILIC (2.1 mm×150 mm, 1.7 μm, Waters)을 사용하였다.

액체크로마토그래프 분석은 시차굴절검출기(Refractive Index Detecor)가 달린 액체크로마토그래프/HPLC (SP, Japan)를 사용하였으며, 컬럼은 NH2-60 (4.6×250 mm, 5 μm, Shiseido)을 사용하였다.

질량분석법 조건

표준품과 시료를 전처리하는 조건은 상기 표준용액의 조제, 시험용액의 조제 란에 기재하였으며, 이 용액을 가지고LC-MS/MS로 분석하는 조건을 검토하였다.

칼럼의 경우 문헌 검토를 통하여 Hilic, C18, 아민 칼럼 세 종류를 선정하고 비교해 보았다. 이동상의 경우도 문헌조사에서 주로 사용한 0.1% 포름산과 아세토니트릴 혼합액에 대하여 조성을 변경하여 검토해 보았다. 유속은 0.3~1.0 mL/min으로 실험한 사례가 있었고 이를 비교 검토하였다.

문헌에서 이온화 조건은 주로 ESI positive mode를 사용하였고, monitoring ion은 글루코사민의 경우 180, 72, 73을, 키토올리고당은 시료를 분해하지 않았기 때문에 50~2,000 범위에 걸쳐 분석하였다.

본 실험에서도 ESI positive mode (Source temperature는 120도, Desolvation temperature는 350도)를 사용하였다.

질량분석법 유효성 확인(Validation)

직선성은 시험용액에서 키토산이 검출되는 농도범위를 중간값으로 설정하여 총 6개의 농도 78, 156, 312, 625, 1,250, 2,500ng/mL에 대하여 검토하였다. 검량선의 기울기(S)와 y절편의 표준편차(σ)에 3.3배를 곱한 값(3.3×σ/S)을 검출한계로, 10배를 곱한 것(10×σ/S)을 정량한계로 설정하였다.

정확도(회수율) 평가에서 공시료는 키토산을 함유하지 않는 비타민 함유 건강기능식품을 구입하여 적합여부를 확인하고 실시하였다. 키토산 표준품을 검량선 범위 내 서로 다른 3개의 농도(300, 600, 900 ng/mL)가 되도록 첨가한 후 5회 반복 측정하여 회수율을 구하였다.

실험실 내 정밀도와 실험실 간 정밀도 평가에는 건강기능식품으로 판매되는 키토산제품 20종을 구매하여 함량 및 부형제를 고려하여 시료를 선정하여 사용하였다. 300, 600, 900 mg, 3가지 양에서 각각 5회 반복 측정하여 평균과 상대표준편차(RSD)를 계산하여 분석법의 정밀도를 평가하였다. 또한, 실험실 간 검증은 3개 기관(경인청, 부산청 및 평가원)에서 실시하였다.

현재 공전에 수재된 키토산 시험법과 비교 검토하기 위하여 제2법으로 실험을 수행하여 직선성, 검출한계 및 정량한계를 구하였다.

질량분석법의 제품 적용성 검토

유통되는 다양한 조성의 키토산 제품을 구입하여 확립된 시험법이 유통 중인 제품 시험에 적용 가능한지를 검토하였다. 이들 시료에 대하여 먼저 현재 공전 수재된 키토산 시험법 제2법(LC/RID)을 실시하여 적합한지를 확인하고, 새로운 질량분석법에 대한 적용성 검토를 수행하였다.

결과 및 고찰(Results and Discussion)

질량분석법의 개발

전처리는 공정서 등 대부분 문헌에서 채택하고 있는 방법으로 시료를 글루코사민으로 산분해하는 방법을 선정하였다(Fig. 1).



Fig. 1. Schematic view of acid hydrolysis in chitosan.

표준품은 키토산과 글루코사민을 사용하는 두 가지 방법을 비교 검토하였으며 키토산을 사용하는 방법이 특이성이 우수하고 오차를 줄일 수 있어 선정하였다.

표준품과 시료를 전처리하는 조건은 방법 중 표준용액의 조제, 시험용액의 조제 란에 기재하였으며, 이 용액을 가지고 LCMS/MS로 분석하는 조건을 확립하였다.

칼럼의 경우 문헌 검토를 통하여 Hilic, C18, 아민 칼럼 세 종류를 선정하고 비교해 본 결과 분리도와 감도가 가장 우수한 Hilic 칼럼으로 선정하였다(Fig. 2). 이동상의 경우도 문헌조사에서 주로 사용한 0.1% 포름산과 아세토니트릴 혼합액에 대하여 조성을 변경하여 검토한 결과 40:60이 가장 적절하였다. 유속은 0.3~1.0 mL/min으로 실험한 사례가 있었고 이를 비교 검토하여 0.3 mL/min으로 선택하였다.



Fig. 2. MRM Chromatograms of Chitosan by Hilic column (A), C18 column (B) and Amine column (C).

문헌에서 이온화 조건은 주로 ESI positive mode를 사용하였고, monitoring ion은 글루코사민의 경우 180, 72, 73을, 키토올리고당은 시료를 분해하지 않았기 때문에 50~2,000 범위에 걸쳐 분석하였다.

본 실험에서도 ESI positive mode를 사용하였다. 이온은 글루코사민 분자량 179에 수소이온이 첨가된 m/z 180 이온을 확인하였고, m/z 180 이온에 대한 딸 이온 스캔 결과, m/z 162, 84, 72 이온 등이 안정적으로 생성되고 감도가 좋아 정성 이온으로 선택하였다. 이 중 감도가 가장 크면서 안정한 m/z 162 이온을 정량이온으로 선정하였다.

이상 LC-MS/MS로 키토산 분석을 위한 조건을 Table 1과 같이 확립하였다.

Analytical conditions for LC-MS/MS in the analytical method of chitosan

Items Conditions
Solvent 0.1% Formic acid : Acetonitrile (40:60)
Column Acquity UPLC® HILIC (2.1 mm×150 mm, 1.7 μm)
Flow rate 0.3 mL/min
Ion mode ESI, positive
Injection vol. 1 μL
Monitor ions (m/z) 180 (precursor ion), 72, 84, 162 (product ion)


질량분석법 유효성 확인(Validation)

키토산의 특이성을 확인하기 위하여 표준용액과 시험용액의 분리도 및 머무름 시간 등을 확인하였다. 표준용액과 시험용액의 피크를 스캔한 결과 머무름 시간에서 선택이온의 상대적 비율이 일치하였으며, m/z 180에서 m/z 72, 84, 162 이온이 확인되었다(Fig. 3).



Fig. 3. Representative MRM chromatograms of chitosan standard (A), sample (B) and mass spectrum (C).

직선성은 6개의 농도, 78~2,500 ng/mL에서 검토한 결과 상관계수(R2)는 0.999 이상이었다(Fig. 4). 검출한계와 정량한계는 각각 51, 154 ng/mL이었다. 기존의 시험법(LC-RID)으로 구한 검량선의 범위는 625~20,000 μg/mL, 검출한계 및 정량한계는 각각 257, 777 μg/mL이었다. 본 연구에서 개발한 질량분석법(LC-MS/MS)이 200배 감도가 높았다.



Fig. 4. Linearity of chitosan according to the concentrations.

정확도는 공시료에 표준물질을 첨가하여 회수율은 측정했을 때 94.8~102.9%로 양호한 결과이었다(Table 2). 정밀도는 시료량 30, 60, 90mg에서 측정하였고 상대표준편차는 0.8~2.5 %이었다. 정확도, 정밀도는 AOAC 가이드라인에서17) 제시하는 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 회수율 범위 75~120%, 상대표준편차 8%)에 모두 적합하였고 높은 정확도와 정밀도를 확인할 수 있었다(Table 3). 실험실간 정밀도 평가에서 3개 실험실 각각 988.8, 966.1, 982.4 mg/g, 상대표준편차는 2.2%로 AOAC 가이드라인 기준(분석물 농도 1 μg/g일 때 상대표준평차 16%)에 만족할 만한 결과를 나타내었으며 분석법의 일관성을 확인할 수 있었다(Table 4).

Validation results (accuracy) of analytical method for the determination of chitosan (n=5)

Spiked Conc. (ng/mL) Measured Mean (ng/mL) (%RSD) Recovery (%)
300 284.3 (3.1) 94.8
600 617.4 (1.3) 102.9
900 896.7 (1.1) 99.6


Validation results (repeatability) of analytical method for the determination of chitosan (n=5)

Sample (mg) Chitosan±SD (mg/g) %RSD
30 970.3±21.7 2.2
60 988.8±25.0 2.5
90 914.2±7.4 0.8


Inter-laboratory validation results (reproducibility) of analytical method for the determination of chitosan (n=5)

LAB No. Measured mean±SD (mg/g) (%RSD) measured mean ±SD (mg/g) %RSD
LAB1 988.8±25.0(2.5)
LAB2 966.1±3.9(0.4) 979.1 ± 21.9 2.2
LAB3 982.4±26.3(2.7)


질량분석법 적용성 검토

확립된 질량분석법을 이용하여 유통되는 키토산 제품 20건에 대하여 함량 시험을 실시하였다. 본 연구를 통해 확립된 키토산 분석법에 대한 적용성을 확인하였다. 그 결과 함량은 표시량에 대하여 80.9~118.3%로 모두 기준에 적합하였고 현재 공전시험법으로 시험한 결과도 80.8~104.4%로 모두 적합하였다(Table 5). 다만 질량분석법에서 키토산 제품 20개 중 6개 검체가 110% 이상으로 다소 높은 함량을 나타내었다.

The contents of chitosan in dietary supplements by LC-MS/MS (n=3)

No Dosage form Other compounds Labeled Content (mg/g) Contents (mg/g) Contents (%)
1 Capsule - 800 646.9 80.9
2 Tablet Vitamin C 750 627.6 83.7
3 Tablet Vitamin B1, B2, C 714 615.4 86.2
4 Capsule - 644 531.9 82.7
5 Capsule Catechin 714 686.1 96.1
6 Tablet - 588 494.2 84.0
7 Capsule - 880 755.7 85.9
8 Tablet HCA, Vitamin C 441 438.0 99.3
9 Tablet - 588 580.1 98.6
10 Tablet HCA 556 511.4 92.1
11 Tablet Vitamin C 667 773.5 116.0
12 Powder Anthraquinone, Vt C Xylooligosaccharide 400 473.2 118.3
13 Capsule - 933 918.9 98.5
14 Tablet Pantothenic acid 711 818.3 115.1
15 Capsule - 714 698.1 97.7
16 Capsule - 880 726.2 82.5
17 Tablet Pantothenic acid 750 862.5 115.0
18 Tablet Vitamin B complex, C, Niacin, Fiber, Se etc, 417 476.3 114.3
19 Tablet Ca 493 513.7 104.2
20 Capsule Vitamin C 760 888.8 116.9


현재 공전 수재 키토산 시험법 제1법은 시료를 산성에서 글루코사민으로 분해한 후 p-디메틸아미노벤즈알데히드(p-dimethylaminobenzaldehyde)를 반응시켜 발색시킨 후 흡광도를 측정하여 분석하는 방법이다. 그러나 본 연구, 키토산의 LC-MS/MS를 이용한 시험법은 분해된 글루코사민을 질량분석기로 직접 측정하는 것으로 발색반응 시 주의를 요하는 숙련도가 크게 필요하지 않고, 발색반응 대기시간 등 3시간 이상 시간이 절약되어 더욱 간편하고 신속한 방법이다. 또한 비색법에서 발생할 수 있는 글루코사민 이외의 다른 성분들에 의한 위양성 반응(false positive response)이 제거되어 더욱 정확한 결과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 검체 산분해 과정에서 생성되는 글구코사민이 아닌 분석물질과 동일한 형태의 키토산을 표준품으로 사용함으로써 산분해 과정상의 글루코사민 단량체 생성의 정도 및 비의도적 다량체(dimer/trimer 등) 생성에 의한 정량성 손실 가능성을 보완하여 정량성을 확보할 수 있었다. 공전 제2법인 LC/RID 시험법과 비교할 때는 감도가 200배 더 높았다. 다만 상대적으로 고가의 장비가 필요하고 시료를 적정한 농도로 희석하는 과정에서 주의가 필요한 것으로 사료된다. 공전에서 키토산은 탈아세틸화도가 80% 이상으로 정의하고 있으나 본 시험법에서는 Acetylated/deacetylated 비율에 따른 정량성의 차이를 측정할 수는 없었다. 이는 공전시험법 제1법 및 2법에서도 마찬가지이다. 이를 보완하기 위해서는 서론에서 언급한 유럽약전의 탈아세틸화도 시험법을 병행할 필요가 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서 확립된 시험법으로 유통제품 20건에 대해 분석한 결과, 표시 함량 대비 80.9~118.3%으로 기준인 80~120%에 적합하고 시험분석이 용이하였다. 이상 건강기능식품 중 키토산의 질량분석법(LC-MS/MS)은 현행 공전 시험과정을 간소화하여 분석시간을 단축하여 분석효율을 증대시켰고, 기존 시험법보다 높은 감도의 시험법임을 확인하였다.

결 론(Conclusion)

키토산 질량분석법을 개발하고 확립하였다. 시험법 검증으로 특이성, 직선성, 검출한계 및 정량한계, 정확성, 정밀성, 실험실 간 재현성을 실시하였고 모두 기준에 적합하였으며 특이성과 감도가 높았다.

본 연구에서 확립된 분석법으로 유통제품 20건에 대해 시험한 결과 전체 시료에서 분석이 용이하였다. 분석한 결과값이 표시기준에 적합하였고 이는 현재 공전시험법(LC/RID)과 유사하였다. 또한 기존 시험법에 비하여 감도가 200배 높아 키토산이 소량 함유된 경우에도 분석이 가능하여 다양한 제품개발에 응용될 수 있을 것으로 나타났다.

특이성·감도 및 효율성이 개선되어 향후 공전 시험법으로 활용 가능하며 건강기능식품뿐만 아니라 의약품, 화장품 분야에서 새로운 제형, 다양한 융복합제품을 개발하는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2018년도 식품의약품안전처의 연구개발비(18161미식안055)로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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October 2022, 66 (5)
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