search for




 

Effect of Artemisia Capillaris Herba Water Extract on Thioacetamide-Induced Liver Injury Animal Model
Yakhak Hoeji 2021;65(3):201-208
Published online June 30, 2021
© 2021 The Pharmaceutical Society of Korea.

Min Ju Kim*, Jin A Lee*, Ji Hye Lee**, Mi-Rae Shin*, and Seong-Soo Roh*,#

*Department of Herbology, Korean medicine of College, Daegu Haany University
**Herbal Medicine Resources Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine
Correspondence to: Seong-Soo Roh, Department of Herbology, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Republic of Korea
Tel: +82-53-770-2350, Fax: +82-53-768-6340
E-mail: ddede@dhu.ac.kr
Received March 15, 2021; Revised April 21, 2021; Accepted June 17, 2021.
Abstract
This study investigated the hepatoprotective effect of Artemisia Capillaris Herba water extract (AC) in a thioacetamide (TAA) induced acute liver damage model using Sprague-Dawley (SD) rats. The in vitro antioxidant activity of AC was measured by quantitating total polyphenol content, total flavonoid content, and DPPH and ABTS free radical scavenging. Our animal experiment was conducted as follows: AC (100 and 200 mg/kg body weight, PO) and silymarin (Sily 100; 100 mg/kg body weight, PO) were administered for 3 days, concurrent with induction of liver injury (TAA, 200 mg/kg body weight, IP). Serum and liver tissue were collected after 3 days of drug administration. AC treatment significantly reduced serum glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamate pyruvate transaminase (GPT), myeloperoxidase (MPO), and ammonia levels. It also effectively decreased protein level expression of NF-κBp65, p-IκBα, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6, and IL-1β in liver tissue, while increasing ZO-1, occludin, claudin-1, claudin-3, and claudin- 4 expression. These results suggest that AC treatment can attenuate inhibition of the NF-κB pathway, and enhancement of the tight junction (TJ) pathway in TAA-induced liver injury. Therefore, AC displays potential for use as a natural therapeutic drug.
Keywords : Artemisia Capillaris Herba, thioacetamide, liver injury
서론(Introduction)

간은 몸 내부에서 가장 큰 기관으로, 중간대사와 지질단백대사 등에 필수적이며, 면역글로불린, 알부민, 응고인자, 효소 등을 함유하고 있는 혈청 단백질의 합성이 일어나는 장소이다.1)최근 불규칙한 식습관, 음주, 스트레스 등으로 면역력이 상실되어 독성물질로부터 사람의 몸을 보호해야하는 간 기능이 손상되어 현대인들에게 간질환이 많이 일어나고 있는데, 이러한 간질환에는 간염에서부터 급성 간손상, 간섬유화, 간경변, 그리고간암이 있다고 알려져 있다.2,3) 특히, 급성 간손상은 사람의 몸안에서 해독대사의 과정에서 기능적 오류를 일으켜 기능 합병증과 신경 행동과 같은 문제를 야기하게 된다.4,5)

Thioacetamide (TAA)은 의료와 제약분야에서 동물에게 간독성을 유발하는 화합물로 사용되었으며, 1948년에 처음으로 설치류에 실험적 간독성 실험이 연구되었다.6) TAA를 동물에 주입하게되면 과산화지질과 활성산소종의 생성과 염증성 단백질들의 발현을 증가시키게 되고, 혈중에서 암모니아의 농도가 올라가는특징적인 임상소견이 나타난다.7,8) 이러한 증상들은 외부에서 항산화 물질을 섭취함으로써 예방과 감소에 효과적인 것으로 알려져 있다.9)

인진호(Artemisia Capillaris Herba)는 중국, 일본, 한국 등에 널리 자생하는 Compositae의 다년생 식물인 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg)의 지상부를 말하며, 생약명으로 인진호(茵蔯蒿) 또는 인진(茵蔯)이라고 한다.10) 예로부터 민간요법에서 간질병에 관련된 치료에 많이 사용되어져 왔다.11) 인진호의 주성분으로는 cineol, alkaloid, scopoletin 등의 정유류와 각종 무기질과비타민류가 있다.12) 한방에서는 인진호를 더위지기라고도 부르며, 성(性)이 약간 차가우며, 미(味)는 쓰며, 간(肝), 비(脾), 위(胃),담경(膽經)으로 들어가 작용하며, 청리습열(淸利濕熱)과 퇴황달(退黃疸)의 효능을 가지고 있다.13) 선행 연구로 간기능 보호, 항비만, 항균, 항산화, 항염증 등이 보고되어져 있으나, TAA로 유발된 간손상 모델에 간보호 효과에 대한 연구에 대해서는 이루어지지 않고 있다.9)

이에 본 연구에서는 TAA로 간손상 유발된 동물모델에 항산화능이 뛰어난 인진호 열수 추출물을 경구 투여하여 간기능에대한 혈액검사와 항산화, 염증 관련 유전자의 발현을 간조직에서 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.

방법(Methods)

시료 추출

본 실험에 사용한 인진호는 옹기한약국(대구, 한국)에서 구입한 것을 구입한 것 대구한의대학교 한의과대학 노성수교수가 생약규격집에 맞추어 관능검사 후, 약전규격에 적합한 것만을 정산하여 사용하였다. 인진호 300 g에 증류수 3000 mL을 가하여열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 감압 추출장치로 농축한 후 동결 건조기를 이용하여 완전 건조시켜 30 g의 파우더(수율 10%, 수분함량 9.25%M)를 얻었다(AC, Artemisia Capillaris Herba water extract). AC는 사용하기 전까지 냉동(−80°C) 보관한 후 실험 직전에 녹여 실험에 사용하였다.

실험 동물

생후 6주령의 체중 200 g 내외의 Sprague-Dawley (SD) (대한바이오링크, 충북, 한국)를 구매하여, 물과 고형사료(Zeigler Bros, Inc., PA, USA)를 충분히 공급하며 일주일간 적응기를 가진 후실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 12시간 주기로 명암주기를 조절하였으며, 온도는 22±2°C,습도는 50±5%로 조절하였다. 실험은 대구한의대학교 동물 실험윤리위원회의 승인(DHU2020-082)을 얻어 시행하였으며 동물관리 규정을 준수하였다.

시약

본 실험에 사용된 L-(+) Ascorbic acid는 Alfa Aesar (Ward Hill, MA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 7 mM 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothia-zoline-6-sulphonic acid) (ABTS), Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, thioacetamide (TAA), gallic acid, potassium persulfate, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), diethylene glycol, naringin, sodium hydroxide은 Sigma Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. phosphorylation of nuclear factor-kappa B p65 (NF-κBp65), inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (IκBα), phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa B alpha (p-IκBα), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 beta (IL-1β), β-actin, histone는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체인 Mouse lgG antibody와 Rabbit lgG antibody는GeneTex, Inc. (Irvine, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 단백질 정량을 위한 bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. Protease inhibitor mixture, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입하였으며, ECL Western Blotting Detection Reagents는 GE Healthcare (Chicago, IL, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

Total polyphenol 함량 측정

AC의 total polyphenol 함량을 측정하기 위해 Folin Ciocalteu’s의 방법을 사용하였다.13) 시료 100 μL에 10배로 희석된 Folin-ciocalteu’s phenol reagent 500 μL와 7.5% sodium carbonate 400 μL를 넣고 잘 혼합하여 30분 암소반응 후, UV 분광광도계(Infinite M200, Tecan, Männedorf, ZH, Switzerland)를 이용하여765 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 gallic acid를사용하였다 (Gallic acid equivalents (GAE).

Total flavonoid 함량 측정

AC의 total flavonoid 함량을 측정하기 위해 aluminum chloride를 사용한 비색법을 사용하였다.13) 시료 100 μL에 10% aluminium chloride solution 20 μL, 1M potassium acetate solution 20 μL및 증류수 560 μL를 넣고 잘 혼합하여 30분 암소반응 후, UV분광광도계를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 quercetin을 사용하였다 (Quercetin equivalents (QE).

DPPH free radical 소거능 측정

항산화 활성을 측정하기 위해 Blosis에 의한 DPPH free radical소거법을 사용하였다.14) AC를 각 농도별로 희석한 용액 100 μL와 60 μM DPPH용액 100 μL을 혼합하여 30분간 암소상태에서반응시킨 후, UV 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도를측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데, 필요한 시료의 양을 IC50으로 하여 나타내었다.

ABTS free radical 소거능 측정

항산화 활성을 측정하기 위해 ABTS free radical 소거능을 측정하였다.15) 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 DW에 녹인 다음 15시간 동안 차광 보관하여 ABTS+를 만든 다음,이 반응액을 415 nm에서 ethanol을 이용하여 흡광도 0.70±02로보정하였다. 만든 ABTS 용액 95 μL에 각 농도별로 희석한 AC를 5μL씩 첨가하여 15분 반응 후 UV 분광광도계를 이용하여415 nm에서 흡광도를 측정하여 ABTS radical 소거능을 계산하여 산출하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50%감소시키는데, 필요한 시료의 양을 IC50으로 하여 나타내었다.

TAA로 유도된 급성 간 손상 동물모델

실험군은 정상군(Normal), 대조군(Control), 양성대조군(Sily100, Silymarin 100 mg/kg/day), 인진호 저농도 투여군(AC100, 인진호열수 추출물 100 mg/kg/day), 인진호 고농도 투여군(AC200, 인진호 열수 추출물 200 mg/kg/day)으로 각 군별로 8마리씩 나눈 뒤 1주일간 동물실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 쥐는 일정한 시간에 1회/1일 체중을 측정하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 1회/1일, 3일간 TAA (200 mg/kg/day)를 복강투여 하였으며, 약물처리군은 TAA 복강 투여와 함께 해당 약물을 3일간 경구 투여 하였다. 실험종료 당일 마취 후 복대정맥에서 혈액을 채취 후, 간 조직을 적출하여 무게를 측정하였다. 혈액은 4°C에서 4,000 rpm으로 10분간 원심 분리 후, 혈청을 분리하여 간 조직과 –80°C 냉동고에 보관하였다.

간 손상 지표 및 ammonia 분석

Glutamic oxaloacetic transaminase (GOT)와 glutamic pyruvic transaminase (GPT)는 assay kit (아산제약, 서울, 한국)로 측정하였으며, ammonia 측정은 ammonia assay kit (Abcam, Cambridge, UK)의 프로토콜을 사용하여 측정하였다.

간 조직 Western blotting

Western blotting 분석을 위하여 간 조직에 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris–HCl (pH 7.5), protease inhibitor cocktail, 15 mM CaCl2, 1.5 M sucrose, 2 mM MgCl2, 0.1 M DTT를 첨가한 buffer A를 넣고 tissue grinder (BioSpec Product, Oklahoma, USA)로 분쇄하고 30분간 아이스 위에서 정치시킨 다음, 10%NP-40 용액을 첨가 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다. 핵을 얻기 위해10% NP-40가 포함된 buffer A에 두 번 헹구고 100 μL의 buffer C (50 mM KCl, 50 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, 0.3 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol)를 넣어서 재부유 시킨 후, 10분 간격으로 vortex를 3번 하였다. 4°C, 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵을 포함하고 있는 상층액을얻었다. 얻어낸 세포질과 핵은 –80°C에서 각각 냉동 보관하였다.간 조직 세포질의 IκBα, p-IκBα, COX-2, TNF-α, IL-1β, ZO-1, claudin-1, claudin-3, claudin-4 및 β-actin과 핵의 NF-κBp65와histone의 단백질 발현을 측정하기 위하여 12 μg의 단백질을10~12% SDS-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동 후, acrylamide gel을 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 이동시킨 membrane에 각각의 1차 antibody를 처리하여 4°C에서overnight 시킨 다음 PBS-T로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체(PBS-T를 사용하여 1:1000로 희석하여 사용)에 사용되는 2차 항체(PBS-T를 사용하여 1:3000로 희석하여 사용)를사용하여 상온에서 2시간 반응시킨 후, PBS-T로 6분마다 5회세척하였다. 그리고 enhanced chemiluminescence (ECL) 용액에노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co. Ltd, Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인하였으며, 해당band를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan)프로그램으로 정량하였다. 각각의 단백질 수준을정상군의 단백질 수준으로 나눈 후 상대적 비로 나타내었다(represented as 1).

통계분석

In vitro의 수치는 평균과 표준편차로 표시하였으며, in vivo 수치는 평균과 표준편차로 표시하였다. 모든 in vivo 수치는 SPSS program for windows version 25.0 (SPSS Inc., Chicago, IL USA)로 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시하였으며, 각 데이터의 통계적 유의성은 Least Significant Difference (LSD) test로 검증하였고, 정상군과 대조군, 대조군과 약물 투여군 사이에 유의성은 p-value <0.05에서 검증하였다.

결과(Results)

Total polyphenol 및 total flavonoid 함량 결과

AC의 항산화 성분 분석을 위하여 total polyphenol 함량과 total flavonoid 함량을 측정하였다. AC의 total polyphenol 함량은240.08±0.70 mg GAE/g으로 측정되었으며, total flavonoid 함량은34.40±0.85 mg QE/g으로 측정되었다(Table 1).

Total Polyphenol, Flavonoid Contents of AC

Sample Total polyphenol (mg GAE/g) Total flavonoid (mg QE/g)
AC 240.08±0.70 34.40±0.85

AC is Artemisia Capillaris Herba water extract.

All data are expressed mean±SEM.



DPPH 및 ABTS free radical 소거능 결과

AC의 항산화 성분 분석을 위하여 DPPH, ABTS free radical소거능을 측정하였다. 대조군으로는 항산화능이 뛰어나다고 알려진 L-ascorbic acid를 사용하였다. DPPH 측정결과, L-ascorbic acid의 IC50값은 1.27±0.03 μg/μL, AC의 IC50값은 8.07±0.48 μg/μL으로 나타났다. ABTS 측정결과, L-ascorbic acid의 IC50값은 3.29±0.04 μg/μL으로 측정되었으며, AC의 IC50값은 29.27±0.38 μg/μL으로 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. DPPH, ABTS free radical scavenging activity of AC. DPPH free radical scavenging activity (A), ABTS free radical scavenging activity (B). AC is Artemisia Capillaris Herba water extract. All data are expressed mean±SEM.

체중변화 및 간 중량 측정 결과

실험기간동안 실험동물의 체중변화는 정상군(11.90±0.58 g)에비하여 대조군(−30.10±3.58 g, p<0.001)에서 유의성 있게 감소하였으며, 대조군에 비하여 Sily100군(−22.85±0.97 g, p<0.01), AC100군(−23.79±1.43 g, p<0.05), AC200군(−21.67±1.14 g, p<0.01)으로 유의적인 증가를 보였다. 또한 간 대 체중 비율(liver to body weight ratio)은 정상군(3.50±0.06%)에 비하여 대조군 (5.04± 0.09%)에서 유의하게 증가함이 나타났으며, 대조군 대비하여Sily100군(4.76±0.07%), AC100군(4.92±0.09%, p<0.05), AC200군(4.85±0.13%, p<0.01)으로 유의성 있게 감소함이 보였다(Fig. 2).

Fig. 2. Body weight change and liver to body weight ratio. Body weight change (A), liver to body weight ratio (B). Normal, normal rats. Control, TAA induced liver injury rats. Sily100, TAA induced liver injury rats treated with silymarin 100 mg/kg body weight. AC100, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 100 mg/kg body weight. AC200, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 200 mg/kg body weight. All data are expressed means ± SD, n=8 rat per group. Significance: ###p<0.001 vs. normal rat, *p<0.05, **p<0.01 vs. TAA-induced control rat.

혈청 내 간 손상 지표 GOT 및 GPT 측정 결과

혈청 내에서 간 손상 지표인 GOT와 GPT를 측정하였다. GOT 측정 결과, 정상군(53.76±1.64 IU/L)에 비하여 대조군(90.00±3.23 IU/L, p<0.001)에서 유의성 있게 증가하였으며, 대조군과 대비하여 Sily100군(82.01±1.73 IU/L, p<0.05), AC100군(81.35±2.84 IU/L, p<0.05), AC200군(73.12±2.27 IU/L, p<0.001)으로 유의성있게 감소하였다(Fig. 3A).

Fig. 3. Expressions of inflammatory-related proteins in liver. Normal, normal rats. Control, TAA induced liver injury rats. Sily100, TAA induced liver injury rats treated with silymarin 100 mg/kg body weight. AC100, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 100 mg/kg body weight. AC200, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 200 mg/kg body weight. All data are expressed means ± SD, n=8 rat per group. Significance: ###p<0.001 vs. normal rat, *p<0.05, **p<0.01 vs. TAAinduced control rat.

GPT 측정 결과, 정상군(4.56±0.60 IU/L)에 비하여 대조군(26.51±1.71 IU/L, p<0.001)에서 유의성 있게 증가하였으며, 대조군과 대비하여 Sily100군(22.06±1.45 IU/L), AC100군(19.79±2.19 IU/L, p<0.05), AC200군(17.40±2.67 IU/L, p<0.01)으로 AC100군과 AC200군에서 유의성 있게 감소하였다(Fig. 3B).

혈청 내 ammonia 농도 측정 결과

혈청 내에서 ammonia 농도 측정 결과, 정상군(12.27±0.45 nmol/µL)에 비하여 대조군(18.47±1.00 nmol/µL, p<0.001)에서 유의성있게 증가하였으며, 대조군과 대비하여 Sily100군(15.46±0.95 nmol/µL, p<0.05), AC100군(13.24±1.67 nmol/µL, p<0.01), AC200군(11.74±0.56 nmol/µL, p<0.001)으로 AC100군과 AC200군에서 유의성 있게 감소하였다(Table 2).

GOT levels, GPT levels, and ammonia concentration in serum

Group GOT (IU/L) GPT (IU/L) Ammonia (nmol/μL)
Normal 53.76±1.64 4.56±0.06 12.27±0.45
Control 90.00±3.23### 26.51±1.71### 18.47±1.00###
Sily100 82.01±1.73* 22.06±1.45 15.46±0.95*
AC100 81.35±2.84* 19.79±2.19* 13.24±1.67**
AC200 73.12±2.27*** 17.40±2.67** 11.74±0.56***

Normal, normal rats. Control, TAA induced liver injury rats. Sily100, TAA induced liver injury rats treated with silymarin 100 mg/kg body weight. AC100, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 100 mg/kg body weight. AC200, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 200 mg/kg body weight. All data are expressed means±SD, n=8 mice per group. All data are expressed means ± SD, n=8 rat per group. Significance: ###p<0.001 vs. normal rat, *p<0.05, **p<0.01, and ***p< 0.001 vs. TAA-induced control rat.



간 조직 내 염증관련 인자 발현

세포질에서 염증관련 인자인 p-IκBα, NF-κBp65, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β를 측정한 결과, 모든 인자들이 정상군과 비교하여 대조군에서 유의하게 증가하는 것을 확인하였으며,대조군에 비하여 모든 약물 투여군에서 발현이 감소하는 것을확인할 수 있었다. 그 중, AC200군은 대조군과 비교하여 감소율이 p-IκBa 19% (p<0.01), NF-κBp65 29% (p<0.001), iNOS 23% (p<0.001), COX-2 21% (p<0.01), TNF-a 17% (p<0.01), IL-6 23% (p<0.001), IL-1b 21% (p<0.01)로 정상군 수준으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4. Expressions of tight junction-related proteins in liver. Normal, normal rats. Control, TAA induced liver injury rats. Sily100, TAA induced liver injury rats treated with silymarin 100 mg/kg body weight. AC100, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 100 mg/kg body weight. AC200, TAA induced liver injury rats treated with Artemisia Capillaris Herba water extract 200 mg/kg body weight. All data are expressed means ± SD, n=8 rat per group. Significance: ###p<0.001 vs. normal rat, *p<0.05, **p<0.01 vs. TAAinduced control rat.

간 조직 내 tight junction관련 인자 발현

세포질에서 tight junction관련 인자인 ZO-1, occludin, claudin-1, claudin-3, claudin-4의 발현량 측정 결과, 정상군에 비하여 대조군에서 유의적으로 감소하였으며, 대조군 대비 모든 약물 투여군에서 증가하는 경향을 나타냈다. 특히 AC200군은 ZO-1과claudin-3에서 각각 증가율이 29.99% (p<0.01), 28.79% (p<0.01)으로 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

고찰(Discussion)

인진호(茵蔯蒿)는 국화과에 다년초에 속해있는 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg)의 지상부를 말린 것으로, 포자엽이 달려 있을 때 채취하여 사용한다. 인진호는 이습황달(利濕退黃), 청리습열(淸利濕熱)하는 효능을 지니고 있어 소변불리(小便不利), 황달 (黃疸) 등의 증상에 주로 사용된다.16) 이러한 인진호는 인간 간암 세초주인 HepG2 cell에서의 염증 억제, 황달, dimethylnitrosamine에 의한 간섬유화, 간암세포사멸 유도 등과 같은 연구들이 보고되어져 있지만 thioacetamide (TAA)로 유도된 간손상에 대한 연구는 보고된 바 없다.17) 이에 본 연구에서는 TAA로 간손상이유발된 동물모델에서 인진호 열수 추출물의 간 보호 및 치료 효과를 확인하기 실험을 진행하였다.

실험을 위해 Sprague-Dawley (SD) 수컷 흰쥐에 TAA (200 mg/kg/day)를 3일간 복강투여하여 간 손상을 유발하였고, 간 손상 유발과 함께 3일간 인진호 열수 추출물(100 mg/kg/day (AC100), 200 mg/kg/day (AC200)을 경구투여 하였다. 3일간의실험 종료 후, 부검으로 얻은 혈청을 통해 glutamic oxaloacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT), ammonia를 측정하였으며, western blotting 분석을 통해 간 조직내 염증 및 tight junction 관련 단백질 인자들의 발현을 측정하였다.

간 손상 지표로 사용되는 GOT는 간, 근육, 심장, 신장에 있는 효소이며, 조직의 손상에 의해 혈중으로 분리되어 수치가 상승하며, GPT는 간 또는 심장에 문제가 생겼을 때 혈중에서 다량으로 검출되어 조직에 이상이 있음을 진단할 경우에 임상학적으로 중요한 효소이다.18) GOT 측정결과, 정상군과 비교하여대조군에서 약 67% 증가하였으며, 대조군에 비하여 AC100군과AC200군에서 약 10%, 19% 씩 유의하게 감소하는 것을 확인할수 있었다. 또한 GPT 측정결과에서도 대조군에 비하여 AC100 군과 AC200군의 감소율이 약 25, 34%으로 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

TAA는 간세포 독성물로, rats에 복강 투여 시 심각한 간손상을 일으키며 간에서 해독되어야 할 ammonia를 분해하지 못해혈중 ammonia 농도가 상승하게 된다.8) 혈중 ammonia 측정결과,정상군에 비해 대조군은 유의한 증가가 있었으며, 인진호 추출물 투여에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.

이후 western blotting으로 간조직의 염증성 단백질을 분석하였다. NF-κB의 발현은 IκBα의 인산화로 인해 서로 분리되어 NF-κB가 핵 내로 이동하면서 염증성 매개인자 및 사이토카인을 유도하게 된다.19) 염증성 단백질 측정결과, 인진호 추출물이 NF-κB p65의 발현을 감소시킴으로 인하여 염증성 매개인자 iNOS, COX-2와 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현량을유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

간은 여러 종류의 상피로 뒤덮여 있는데, 이는 내부와 외부환경 사이에 있는 선택적 장벽인 tight junctions으로 효율적으로유지가 된다고 알려져 있다.20) 간 조직에서 western blotting을 통해 tight junctions 관련 단백질의 발현량을 측정한 결과, occludin, claudin-1, claudin-4에서 대조군 대비 인진호 추출물에서 발현량이 증가하였으며, ZO-1과 claudin-3에서는 인진호 추출물 투여에의해 농도 의존적으로 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 인진호 추출물은 간조직 상피의 기능유지에 효과적인 것으로 사료되어진다.

결론(Conclusion)

본 연구는 TAA로 유발된 급성 간손상 동물모델에서 인진호추출물을 경구 투여하여 간 보호 효과를 확인하여 다음과 같은결론을 얻었다.

TAA로 유발된 급성 간손상 동물모델에서 인진호 추출물의 투여는 혈중에서 간손상 지표인 GOT, GPT와 ammonia 농도를 유의하게 감소시켰다. 또한 인진호 추출물의 투여로 인하여 염증성 단백질의 발현을 감소시켰으며, tight junctions 관련 단백질의발현을 증가시켰다.

따라서 TAA로 급성 간손상 유발시 인진호 추출물은 염증성전사인자인 NF-κB의 활성화로 인해 일어난 염증 과정을 억제하며, tight junctions 관련 단백질의 발현을 증가시켜 간조직 상피의 기능유지를 통해 간보호 효과를 보이는 것으로 사료되어진다.

감사의 말씀(Acknowledgment)

이 논문은 2021년도 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임(No. 2018R1A5A 2025272).

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

References
  1. Wang H, Zhang H, Wang Y, Yang L, Wang D (2019) Embelin can protect mice from thioacetamide-induced acute liver injury. Biomed Pharmacother 188: 109360.
    Pubmed CrossRef
  2. Zhao YJ, Lee SH, Huh JW, Ra JC, Sohn DH (2012) Hepatoprotecive Effects of Alnus japonica Extract on Experimental Liver Injury Models. Yakhak Hoeji 56: 99-107.
  3. Shin MR, Kim KJ, Kim SH, Lee JH, Kwon OJ, Roh SS (2018) Effect of Youngyanggak-san against Thioacetamide Induced Acute Liver Damage in Rat. Kor J Herbol 33: 47-55.
  4. Ashkani-Esfahani S, Bagheri F, Emami Y, Esmaeilzadeh E, Azarpira N, Hassanabadi N, Keshtkar M, Farjam M, Koohi-Hosseinabadi O, Noorafshan A (2016) Protective Effects of Co-Enzyme Q10 on Thioacetamide-Induced Acute Liver Damage and Its Correlation With Behavioral, Biochemical, and Pathological Factors. Iran Red Crescent Med J 18: e29166.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  5. Kim OK (2001) Protective Effects of Extracts of Diospyrus kaki Folium against Hepatotoxicity in Carbon Tetrachloride Intoxicated Rats. J Korean Soc Food Sci Nutr 30: 97-101.
  6. Fitzhugh OG, Nelson AA (1948) Liver tumors in rats fed thiourea or thioacetamide. Science 108:626-628.
    Pubmed CrossRef
  7. El-Kashef DH, Serrya MS (2019) Sitagliptin ameliorates thioacetamide-induced acute liver injury via modulating TLR4/NF-KB signaling pathway in mice. Life Sci 228: 266-273.
    Pubmed CrossRef
  8. Kim KJ, Shin MR, Kim SH, Kim SJ, Lee AR, Kim OJ, Roh SS (2018) Protective Effect of Tongyuhwalhyeol-tang on Liver Injury in Thioacetamide-induced Rat. Kor J Herbol 33: 37-46.
  9. Lee YJ, Seo BI, Roh SS (2016) Improving effect of Artemisiae Capillaris Herba extract in reflux esophagitis rats. Kor J Herbol 31: 37-44.
    CrossRef
  10. Kim JS, Kim KL (2015) Anti-oxidative and Anti-inflammatory Effects of Artemisiae Capillaris Extract. Kor J Aesthet 13: 805-812.
    CrossRef
  11. Kim KS, Park JH (1992) Effect of Artemisia Iwayomogi water extract on hepatic injury by carbon tetrachloride in rats I. Effect on serum AST, ALT, LDH activities, lipid content and liver peroxide content. Korean J Vet Res 32: 347-356.
  12. Seo YS, Lee E, Cha YY (2020) Anti-inflammatory Effect of Artemisia Capillaris Thunberg in Lipopolysaccharide-exposed Rats. J Oriental Rehab Med 20: 27-35.
  13. Rama P, Vignesh A, Lakshmanan G (2013) In vitro antioxidant activity of achyranthes aspera linn. Int J Med Pharm 2013: 67-78.
  14. Blosis MS (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 26: 1199-1200.
    CrossRef
  15. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26: 1231-1237.
    CrossRef
  16. Noh DJ, Choi JG, Hong SS, Oh MS (2018) Comparison of Antiinflammatory effects between Artemisia capillaris and Artemisia iwayomogi by extraction solvents. Kor J Herbol 33: 55-61.
  17. Hong SH, Seo SH, Lee JH, Choi BT (2004) The aqueous extract from Artemisia capillaris Thunb. inhibits lipopolysaccharideinduced inflammatory response through preventing NF-kappaB activation in human hepatoma cell line and rat liver. Int J Mol Med 13: 717-720.
    CrossRef
  18. de David C, Rodrigues G, Bona S, Meurer L, González-Gallego J, Tuñón MJ, Marroni NP (2011) Role of quercetin in preventing thioacetamide-induced liver injury in rats. Toxicol Pathol 39: 949-957.
    Pubmed CrossRef
  19. Liu A, Shen Y, Du Y, Chen J, Pei F, Fu W, Qiao J (2018) Esculin prevents Lipopolysaccharide/D-Galactosamine-induced acute liver injury in mice. Microb Pathog 125: 418-422.
    Pubmed CrossRef
  20. Roehlen N, Roca Suarez AA, El Saghire H, Saviano A, Schuster C, Lupberger J, Baumert TF (2020) Tight Junction Proteins and the Biology of Hepatobiliary Disease. Int J Mol Sci 21: 825. Authors’ Positions
    Pubmed KoreaMed CrossRef


August 2021, 65 (4)
Full Text(PDF) Free

Social Network Service
Services

Cited By Articles
  • CrossRef (0)

Funding Information